- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
Занятие 1
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ. ПОДГОТОВКА КЛЕТОК К АНАЛИЗУ. МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ. РАСЧЁТНЫЕ ЗАДАЧИ.
ВВОДНАЯ ЧАСТЬ
Конечной целью изучения ферментных систем бактерий является получение исчерпывающей информации о различных реакциях, протекающих в клетках, которая позволила бы понять, как эти реакции вплетены в ткань жизненных процессов. В идеале такие исследования должны проводиться на растущих клетках с интактной структурой и ненарушенным метаболизмом. Во многих случаях это удается осуществить, однако чаще всего приходится использовать менее идеальный источник получения клеточных компонентов.
Прежде всего исследователь должен решить, какой тип препарата больше всего соответствует целям эксперимента. И, хотя уже проведено огромное количество экспериментов на сотнях различных штаммов бактерий, очень трудно сформулировать какие-либо определенные рекомендации относительно выбора «наилучшего» метода. Здесь применимо только правило оптимального выбора: использовать препараты дезинтегрированных клеток в тех случаях, когда их невозможно сделать проницаемыми, и делать клетки проницаемыми, если нет возможности работать с интактными покоящимися или растущими клетками.
ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Обменом веществ, или метаболизмом называется совокупность протекающих в клетке процессов, обеспечивающих воспроизводство биомассы микроорганизмов. Клеточный метаболизм прокариот складывается из двух потоков реакций, имеющих разную направленность: энергетического и конструктивного метаболизма.
Ферменты - белковые комплексы, с участием которых протекают в микробной клетке все обменные процессы, они состоят из двух частей:
1) однокомпонентная, или белковая группа, в состав которой входит белок-носитель (апофермент);
2) простетическая, или активная группа (кофермент).
В отдельности белковая и простетическая группы не обладают ферментативной активностью и только после соединения приобретают свойства ферментов, для которых характерны: специфичность действия, термолабильность, зависимость от реакции среды (рН). Экзоферменты выделяются в окружающую среду, где производят превращение питательных веществ в более простые соединения. Эндоферменты прочно связаны с цитоплазмой, осуществляют дальнейшее расщепление поступающих питательных веществ и превращение их в составные части клетки.
Скорость роста микроорганизмов - функция скоростей координированного биосинтеза всех компонентов биомассы и скорости клеточного деления - регулируется на многих этапах метаболизма.
«Узкое место» - один из участков сложной сети биохимических реакций, в определенных условиях лимитирующий общую скорость метаболизма и, даже в оптимальных условиях роста, лимитирующий скорость размножения клеток. Выявление такого «узкого места» чрезвычайно важно для получения максимального выхода биомассы и ценных для человека продуктов метаболизма в случае использования микроорганизмов в биотехнологических процессах.
СОДЕРЖАНИЕ УЧЕБНЫХ ВОПРОСОВ