1.1.5 Использование клеточных экстрактов

Большинство описанных выше методик можно осуществить, используя вместо целых клеток клеточные экстракты. Накопление промежуточных продуктов и (или) кофакторов может происходить спонтанно, или его можно инициировать, используя метаболические яды или аналоги субстратов. При использовании клеточных экстрактов трудности, связанные с проникновением веществ в клетки, устраняются, что упрощает анализ, Однако ферменты изучаемого пути метаболизма не находятся при этом в своей естественной среде, и поэтому их активность может изменяться или они вообще могут быстро инактивироваться.

1.1.6 Использование радиоизотопов

Использование радиоизотопов, в частности соединений, содержащих ¹⁴С, ³²Р, ³Н или ³⁵S, чрезвычайно важное средство изучения путей метаболизма. Описание и оценку различных методик, разработанных для этой цели, здесь мы рассмотрим лишь в общих чертах.

Во-первых, следует отметить, что эти методики имеют свои трудности и «подводные камни». Главнейшая из трудностей связана с необходимостью работы с чистыми веществами. «Перед использованием радиоактивной метки необходима тщательная проверка ее чистоты, так как лучше вообще не работать, чем работать с не чистым исходным веществом». Так, длительные попытки проследить путь второй транспортной системы для глюкозо-6-фосфата, были безуспешны только по причине артефакта, возникающего из-за присутствия небольшого количества примеси свободной ¹⁴С-глюкозы во всех препаратах ¹⁴С-глюкозо-6-фосфата, за исключением свежеприготовленных. Эти соединения были использованы в опытах в качестве субстрата.

Даже при использовании чистых веществ, проследить судьбу меченых молекул одного вида среди несметного числа взаимосвязанных и часто обратимых потоков метаболических реакций непросто. Чем быстрее метаболиты входят в активные метаболические пулы, тем труднее выявить их специфические функции. Поскольку активно делящиеся бактерии (в отличие от покоящихся клеток) прежде всего осуществляют реакции синтеза, оборот и перераспределение метаболитов у них сводится к минимуму. Поэтому для радиоизотопного анализа путей метаболизма рекомендуется использовать по возможности активно делящиеся бактерии. Полезно также использование соответствующих мутантных штаммов с дефектом, который снижает до минимума или исключает распределение и (или) оборот метаболитов.

В ряде случаев успешно применяется метод быстрого отбора проб. Он оказался эффективным при изучении пути фиксации ¹⁴СО₂ одноклеточными зелеными водорослями. С его помощью был обнаружен глиоксалатный цикл у Pseudomonas и других организмов. Согласно этому методу, радиоактивную метку добавляют к клеткам на очень короткое время (секунды или минуты), а затем сразу же определяют меченые продукты.

Для анализа путей метаболизма можно также использовать метод конкуренции изотопов. Этот метод основан на том, что при мечении всех компонентов, участвующих в определенном пути метаболизма, добавление немеченого компонента вызывает пропорциональное снижение удельной радиоактивности всех метаболитов начиная с добавленного. Этот метод широко и успешно применили в классических исследованиях биосинтеза аминокислот у Е. coli.

Метод радиореспирометрии относится к классу методов, с помощью которых можно измерять дыхательную активность биологической системы. С его помощью изучают скорость и степень превращения ¹⁴С-субстрата (например, 1-¹⁴С-глюкозы, 3,4-¹⁴С-глюкозы или DL-1-¹⁴С-глутамата) в СО₂, выделяющийся при дыхании. Этот метод используется для анализа путей катаболического дыхания у дрожжей и различных бактерий, включая среди прочих Brevibacte-rium, Arthrobacter, Xanthomonas, Corynebacterium, Neisseria и Escherichia. Он широко применяется для определения потока углерода через взаимосвязанные пути, такие, как путь Эмбдена - Мейергофа - Парнаса, путь Энтнера - Дудорова, пентозофосфатный путь, путь глюкуроновой кислоты и цикл трикарбоновых кислот.

Как и другие методы исследования, радиореспирометрия имеет определенные недостатки и ограничения. Как правило, он требует изготовления специального оборудования, которого нет в продаже. Его, впрочем, можно изготовить с минимальными затратами, как, например, в случае блока с шестью сосудами (рис. 9). Стеклодув может легко превратить 250 мл колбы Эрленмейера в сосуды для радиореспирометрии, а обычные хроматографические колонки - в устройства для улавливания СО₂. Список необходимого оборудования включает измеритель потока газа, термостатируемую качалку, штатив для укрепления измерителя потока и поглотителя СО₂, и жидкостный сцинтилляционный счетчик. Ограниченность использования этого метода обусловлена тем, что некоторые соединения, специфически меченные ¹⁴С, которые могут потребоваться при проведении определенных работ, отсутствуют в продаже.