- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
1.1 Интактные клетки
1.1.1 Растущие клетки
Все основные жизненные процессы, протекающие в активно растущих бактериях, включая размножение, имеют высокоорганизованный и строго регулируемый характер и во многих отношениях представляют собой идеальную систему для исследования ферментов. Во время роста клеток все их метаболические системы находятся в подвижном равновесии: питательные вещества и ионы поступают в клетки, а конечные продукты метаболизма выводятся. Во всех случаях, когда это возможно, желательно использовать интактные растущие клетки.
1.1.2 Покоящиеся клетки
Рост клеток можно остановить, если отделить их (путем центрифугирования или фильтрации) от питательной среды и суспендировать в «нейтральной», осмотически подходящей среде, например забуференном физиологическом растворе или минерально-солевой среде, лишенной источников углерода и азота. Обработанные таким образом клетки называются покоящимися. Они обладают тем же набором ферментов, что и растущие клетки, но находятся в относительно неактивном состоянии. На таких клетках можно изучать реакции или группы реакций, представляющие особый интерес. Например, можно определять поток электронов, идущий от субстратов, таких, как D-лактат или сукцинат, через систему дыхания в условиях, когда рост и метаболические требования минимальны. Покоящиеся клетки некоторых видов способны синтезировать белки, и их часто используют для изучения этого процесса. Кроме того, покоящиеся клетки служат объектом при изучении транспортных процессов, включая транслокацию субстратов и ионов. С этой целью отмытые клетки обычно суспендируют в осмотически пригодной среде, содержащей для подавления синтеза белка хлорамфеникол (50-100 мкг/мл). При проведении некоторых экспериментов, например связанных с изучением транспорта, часто рекомендуется использование эндогенных источников энергии.
1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
Бывают случаи, когда клетки полностью лишают эндогенных источников энергии. Прекрасный пример использования голодающих покоящихся клеток - измерение внутриклеточного АТР, образующегося за счет хемиосмотического мембранного потенциала. В неголодающих клетках выявление АТР, синтезированного за счет хемиосмотического градиента, затруднительно из-за высокого фонового уровня АТР. Методика голодания для Е. coli была разработана Кохом. При ее использовании клетки Е. coli быстро утилизируют резервные питательные вещества в циклическом процессе фосфорилирования/дефосфорилирования α-метилглюкозида, который у этих бактерий фосфорилируется при участии фосфоенолпируват-фосфотрансферазной системы. Клетки собирают центрифугированием при 4°С и промывают основной средой или 0,12 М трис-НС1, рН 8,0. Затем их суспендируют до плотности 5 мг клеток (сухого веса) на 1 мл основной среды, содержащей 20 мМ α-метилглюкозида и 40 мМ азида натрия, и инкубируют при 37°С от 45 до 120 мин в зависимости от используемого штамма. После этого клетки снова центрифугируют, промывают и ресуспендируют в соответствующем растворе.
Более обычный способ подавления эндогенного метаболизма, по крайней мере у аэробов или факультативных аэробов, заключается просто в энергичном аэрировании густой суспензии клеток (в основной среде или буфере) в течение 2-4 ч или дольше, если это необходимо. За сокращением запасов питательных веществ в клетках можно следить, измеряя максимальное снижение эндогенного дыхания Q (О2) относительно уровня Q (О2), необходимого для окисления какого-либо субстрата, например глюкозы.