Теоретичні питання

1. Біохімічна активність бактерій. Класифікація ферментів бактерій.

2. Мета та методи вивчення ферментативної властивості бактерій.

3. Значення вивчення біохімічної активності бактерій для ідентифікації.

4. Використання ферментів бактерій в медичній практиці та промисловості.

5. Антибіотики, хіміопрепарати: класифікація за спрямованістю та механізмом дії. Одиниці вимірюванняантимікробної активності антибіотиків.

6. Хіміотерапія, хіміопрофілактика, хіміотерапевтичні засоби та хіміотерапевтичний індекс: поняття та використання на практиці.

7. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків (антибіотикограма). Стійкість до антибіотиків.

8. Принципи раціональної антибіотикотерапії.

9. Ускладнення антибіотикотерапії.

10. Механізм формування та поширення резистентності мікроорганізмів до хіміотерапевтичних засобів, шляхи її подолання.

Практична робота

Робота 1. Вивчити та зарисувати демонстрацію у протокол

Демонстрація

1. Строкаті ряди кишкової палички, сальмонел черевного тифу, паратифів А і В.

Разом із культуральними, морфологічними, тинкторіальними властивостями необхідно вивчати й біохімічну активність бактерій. При визначенні виду патогенних мікроорганізмів найбільше значення має визначення цукролітичних та протеолітичних ферментів у бактерій. Класичний метод ідентифікації мікроорганізмів за біохімічними ознаками полягає в посіві чистої культури на диференціально-діагностичні середовища. Дослідження займає не менше ніж 1 добу. Прикладом є оцінка здатності ферментувати вуглеводи за допомогою посіву на середовища Хісса – короткий та довгий „строкатий ряд”.

При дослідженні біохімічних або ферментативних властивостей бактерій чисту культуру досліджуваного мікроорганізму засівають бактеріальною петлею в середовища „строкатого ряду”. Посіви інкубують при 37º С впродовж18 – 24 годин. Бактерії ферментують вуглеводи з утворенням кислоти, спостерігається зміна кольору середовища та газу (з’являються бульбашки газу у поплавку).

Для виявлення протеолітичних ферментів посів можна виконувати на пептонну воду, бажано бульйон Мартена.

Кінцевими продуктами розпаду білків є сірководень, індол та ін. Виявлення їх здійснюється різними методами.

Виявлення індолу. До культури мікроорганізмів на пептонній воді додають декілька крапель ефіру, потім пробірку струшують і нашаровують реактив Ерліха (спиртовий розчин парадиметиламідобензальдегіду із соляною кислотою). За наявності індолу спостерігається утворення малинового кільця.

Виявлення сірководню. Папірець, заздалегідь змочений ацетатом свинцю і розміщений під пробкою, у пробірці з бульйонною культурою за наявності сірководню чорніє внаслідок утворення сірчистого свинцю.

Таблиця 2 – Диференціація кишкової палички, сальмонел черевного тифу,

паратифів А і В за біохімічною активністю на середовищах Хісса

Вид мікроба	Глю- коза	Лак- тоза	Ма- ніт	Маль- тоза	Саха-роза	Пептонна вода
						Н2S	індол
Кишкова паличка Сальмонела черевного тифу Сальмонела паратифу А Сальмонела паратифу В	КГ К КГ КГ	КГ - - -	КГ К КГ КГ	- К КГ КГ	- - - -	- + - +	+ - - -
Умовні позначки: К –кислота; КГ – кислота і газ

2. Середовища Ендо, Левіна, бактоагар Плоскірєва з посівом суміші кишкової палички та сальмонел черевного тифу

Зверніть увагу, що на середовищі Ендо виросло декілька різновидів колоній. Кишкова паличка утворює колонії червоного кольору, інколи з металевим відтінком, сальмонели черевного тифу безбарвні.

Середовище Ендоскладається з м'ясопептонного агару, 1% розчину лактози та індикатора у вигляді основного фуксину, знебарвленого сульфітом натрію (фуксиносірчиста кислота). Мікроорганізми, які мають фермент лактазу (лактозопозитивні мікроорганізми), ферментують лактозу з утворенням альдегідів, фуксиносірчиста кислота переходить в альдегідсірчисту сполуку. Фуксин вивільняється, забарвлюючи колонії в червоний колір. Лактозонегативні бактерії утворюють безбарвні колонії на середовищі.

Рисунок 34 – Ріст E.coli та S.typhi на середовищі Ендо

Середовище Левінаскладається з м'ясопептонного агару, 0,5% водного розчину метиленового синього, 2% розчину еозину, лактози та двохосновного фосфорно-кислого калію. Це середовище має темно-фіолетовий колір. Лактозопозитивні бактерії утворюють колонії синього кольору (кишкова паличка), лактозонегативні – безбарвні колонії (дизентерійні бактерії).

Рисунок 35 – Ріст E.coli та S.typhi на середовищі Левіна

Бактоагар Плоскірєваскладається з м'ясопептонного агару, лактози, брильянтового зеленого, солей жовчних кислот, мінеральних солей та індикатора нейтрального червоного. Це середовище є не тільки диференціально-діагностичним, але й елективним, оскільки воно пригнічує ріст багатьох мікроорганізмів (мікроорганізмів повітря, кишкової палички та ін.), сприяє кращому росту збудників черевного тифу, паратифів та дизентерії. Лактозонегативні бактерії утворюють безбарвні колонії, а лактозопозитивні – червоного кольору.

Рисунок 36 – lac+ та lac- колонії на середовищі Плоскірєва

3. Кров'яний агар і середовище Чистовича з ростом патогенного стафілокока

Кров'яний агарскладається з 2% м'ясопептонного агару та 5 – 10% дефібринованої стерильно взятої крові кролика або барана. Середовище червоного кольору. Це середовище використовується для визначення гемолітичної активності бактерій. Так, наприклад, навколо колоній у деяких штамів стафілокока на кров'яному агарі виявляється зона гемолізу.

Рисунок 37 – Зона гемолізу навколо колоній стафілокока на кров’яному агарі

Середовище Чистовича (ЖСА) складається з 10% сольового м'ясопептонного агару, 20% жовткової зависі (1 жовток на 150 – 200 мл стерильного фізіологічного розчину). Висока концентрація хлористого натрію забезпечує переважний ріст стафілококів. Середовище застосовується для визначення лецитовітелазної активності стафілококів. Деякі штами синтезують фермент лецитиназу, який руйнує лецитин, що входить до складу оболонок еритроцитів людини, барана, кроля. Колонії лецитинпозитивних стафілококів оточені зоною помутніння. Продукція лецитинази – одиніз критеріїв патогенності.

Рисунок 38 – Лецитовітелазна зона навколо колоній стафілокока на ЖСА

4. Ріст бактерій на середовищі Олькеницького

Рисунок 39 – Ріст бактерій на середовищі Олькеницького

5. Пробірки з позитивною та негативною реакціями плазмокоагуляції

Для виявлення коагулази (фермент патогенності мікроорганізмів, який сприяє зсіданню плазми крові, полегшує проникнення бактерій у тканини) використовують реакцію плазмокоагуляції.

Штами стафілокока, що продукують фермент плазмокоагулазу, викликають зсідання плазми (позитивна реакція), внаслідок чого вона перетворюється на драглеподібну масу, яка не виливається при перевертанні пробірки. Штами стафілокока, які не мають плазмокоагулази, не змінюють плазми (негативна реакція).

Рисунок 40 – Негативна та позитивна реакція плазмокоагуляції

Препарати з антибіотиками та диски з антибіотиками

Антибіотики – продукти метаболізму живих мікроорганізмів або їх синтетичні аналоги, що вибірково пригнічують ріст мікроорганізмів або пухлинних клітин. Антибактеріальні препарати (природні та синтетичні антибіотики) використовують для лікування інфекційних захворювань. Для ефективної терапії необхідний підбір препарату, що має найбільшу активність відносно даного збудника інфекції.

Рисунок 41 – Паперові диски просочені антибіотиками

Антибіотики мають певну силу дії, зазначену в одиницях дії (ОД). За одиницю дії берутьте вагове значення антибіотика, яке при розведенні в 1мл розчину дає бактеріологічну дію на певну дозу стандартного штаму мікроорганізму. Наприклад, натрієва сіль пеніциліну вміщує в 1мг 1630 ОД, сульфат стрептоміцину – 720 ОД, сульфат тетрацикліну – 910 ОД. При визначенні сили дії антибіотика використовують стандартні культури грамнегативних та грампозитивних бактерій: для пеніциліну – золотистий стафілокок, для стрептоміцину –E.coli.

6. Виявлення фітонцидів часнику

Невелика кількість розтертого часнику, внесена на центр чашки з МПА, припиняє розмноження патогенного стафілокока на поверхні агару.

Рисунок 42 – Схема постановки дослідузвизначеннячутливості до фітонцидів часнику

7. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків методом серійних розведень

Таблиця 3 – Визначення чутливості бактерій до пеніциліну методом серійного розведення антибіотика у рідкому середовищі

Номер пробірки	Концентрація пеніциліну, ОД	Інгредієнт
		МПБ	пеніцилін, 32 ОД	стафілококи, 2х10^5клітину 1 мл	облік досліду
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14	16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,062 0,031 0,0155 0,08 Контроль антибіотика Контроль культури	2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0	2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 -	0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 - 0,2	- - - - - - - - - + + + - +
2 мл вилити в дезінфікуючийрозчин Примітка. Стрілкою позначений перенесення розчину з пробірки в пробірку. Для визначення чутливості стафілокока до пеніциліну добову агарову або вирощену на рідкому середовищі дослідну культуру розводять за оптичним стандартом до 200000 тисяч мікробних тілу1 мл.

Користуючись попередньо підготовленими і засіяними тест-культурами мікроорганізмів,вирахуйтемінімальну бактеріостатичну концентрацію досліджуваного препарату. За допомогою демонстраційних чашокіз висівами з пробірок,уяких візуально не видно росту, вирахуйте мінімальнубактерицидну концентрацію препарату.

Для проведення досліду беруть 14 пробірок, уякі наливають по 2 мл МПБ.У1-шу і 13-ту пробірки наливають по 2 мл основного розведення антибіотика, що вміщує 32 ОД пеніциліну. Потім додають ряд послідовних розведень шляхом перенесення 2 мліз першої пробірки в другу і так далі до 12-ї пробірки. У 12-йпробірці в 2 мл буде міститися 0,008 ОД пеніциліну.

У кожну пробірку додають 0,4 мл суспензії стафілокока. У 13-й і 14-й пробірках міститься 2 мл МПБ із культурою мікроба без антибіотика і контроль антибіотика без культури. Після перебування посівівутермостатівпродовж24 годин реєструють результати досліду.

Знаком "-" відмічають відсутність росту, знаком "+" – ріст досліджуваного мікроорганізму.

Через 1 добу визначають мінімальну бактеріостатичну (що пригнічує) концентрацію антибіотика. За неї беруть найменшу концентрацію антибіотика, при якій не відбувається розмноження бактерій і вміст пробірки залишається прозорим.

Для визначення мінімальної бактерицидної концентрації антибіотика з пробірок, уяких відсутній ріст, роблять посів на чашку з МПА секторами. На секторах зазначають концентрацію антибіотика, з якого зроблений посів. Посіви інкубують 24 години. Через 1 добу, вивчаючи чашки, визначають мінімальну бактерицидну концентрацію антибіотика за відсутностіросту бактерій на агарі у секторах.

8. Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків диско-дифузійним методом

Метод грунтуєтьсяна дифузії антибіотика з просоченого антибіотиком диска фільтрувального паперу у щільне поживне середовище. Постановка диско-дифузійного методу проводиться таким чином. У стерильні чашки Петрі розливають по 20 мл МПА. На поверхню середовища проводять посів «газоном» добової культури мікроорганізмів. Потім за допомогою стерильного пінцетарозкладають диски з антибіотиками. Дискирозкладають на однаковій відстані один від одного і на відстань 2,5 см від центра чашки. Одну чашку можна використовувати для вивчення чутливості одного штаму до 4 – 6 антибіотиків. Чашки витримують 30 хвилин при кімнатній температурі (період предифузії препаратів у середовище). Потім чашки інкубують у термостаті при 37º С 16 – 18 годин.

Рисунок 43 – Диско-дифузійний метод визначення чутливості до антибіотиків

Диск просочений антибіотиком

Зона затримки росту бактерій

При оцінці результатів досліду визначають діаметр зон затримки росту в мм і порівнюють зі стандартними величинами зон затримки росту, на підставі чого відносять мікроорганізми до чутливих, помірно чутливихабо резистентних. Цей методунаслідок простоти і доступності застосовується в усіх практичних лабораторіях.

Для контролю відтворення й точності результатів у випадку визначення чутливості при кожномупроведеннітесту паралельно зі штамами, які досліджуються, необхідно використовувати еталонні штами:E. coli (АТСС 25922),S. aureus (АТСС 25923) іP. aeruginosa (АТСС 27853).Якщо діаметри зон затримки росту еталонних штамів виходять за встановлені межі, то результати чутливості будуть необ’єктивними й свідчать про незадовільну якість середовища, дисків або порушення методики проведеннядосліду.

Робота 2. Провести ІV етап виділення чистої культури Escherichia coli із суміші бактерій

Слід зазначати, що на другому етапі проводився посів частини колонії на скошений МПА для накопичення чистої культури. На наступний день (ІІІ етап) після інкубації звертаютьувагу на особливості росту бактерій на середовищі та роблять мазок, фарбуючи його за методом Грама, з метою перевірки культури на чистоту. Якщо під мікроскопом спостерігаються бактерії однотипової морфології, розмірі тинкоріальних властивостей (грамнегативні короткі палички), роблять висновок, що вона чиста.

Однак морфологічна, тинкторіальна та культуральна ідентифікація недостатня, щоб зробити висновок про вид виділених бактерій. Тому вивчають цукролітичні, протеолітичні, пептолітичні, гемолітичні та антигенні властивості, утворення ферментів: ДНК-ази, оксидази, фібринолізину, плазмокоагулази тощо. Для вивчення цукролітичних властивостей накопиченої чистої культури на ІІІ етапі проводять її засів на середовища Хісса («строкатий» ряд), який інкубують 18 – 24 години при температурі 37° С у термостаті. Врахування результатів ферментативної активності проводять на останньому етапі.

Для виконання поставленогозавданняу роботі необхідно виконатитакіманіпуляції:

а) врахувати ферментативні властивості виділеної чистої культури (на середовищах Хісса – "строкатий" ряд, індолоутворення). Пояснення у демострації 1.

Зміна кольору середовища свідчить про зміну рН живильного середовища внаслідок розщеплення середовища Гісса з певним вуглеводом бактеріальною культурою. Зверніть увагу на те, що E. coli розщеплює такі вуглеводи, як глюкоза, лактоза, маніт до кислоти та газу, тобто разоміз зміною кольору середовища спостерігається наявність газу в поплавках.

Рисунок 44 – Ріст E.coli на середовищах Хіссі

в) Визначити фермент каталазу.

Для визначення ферменту каталази на предметне скло петлею нанесіть мікробну масу (культуру кишкової палички) і додайте краплю розчину перекису водню. Виділення бульбашок кисню свідчить про наявність у даних бактерій каталази.

У протоколі відмітьте результат реакції на каталазу та результати сахаролітичної активності виділеної чистої культури.

в) Зробіть підсумок за результатами дослідів про виділену чисту культуру, враховуючи морфологічну, тинкторіальну, культуральну та біохімічну ідентифікацію.

Робота 3. Провести ІV етап виділення чистої культури стафілокока зі слизової носа.

Після перевірки чистоти виділеної культури на ІІІ етапі проводяться посів цієї культури у стовпчик середовища Хісса з манітом, постановка диско-дифузійного методувизначення чутливості до антибіотиків, реакції плазмокоагуляції.

Для виконання поставленогозавданняу роботі необхідно виконатитакіманіпуляції:

а) Врахувати результати ферментації маніту.

Зміна кольору індикатора свідчить про зміну рН живильного середовища внаслідок розщеплення маніту бактеріальною культурою, що свідчить про патогенність стафілокока. Результати досліду запишіть у єдиний протокол.

Рисунок 45 – Ріст S. aureusу середовищі Хісса

б) Врахувати результати проби на плазмокоагулазу.

Зверніть увагу на те, що проба є позитивною, бо штами стафілокока, що продукують фермент плазмокоагулазу, викликають зсідання плазми, внаслідок чого вона перетворилася на драглеподібну масу, яка не виливається при перевертанні пробірки. Результати проби запишіть у єдиний протокол.

в) Врахувати результати досліду на визначення чутливості виділеної чистоїкультури до антибіотиків та хімічних речовин.

Виявлення дії різних антибіотиків на культуру стафілокока проводилося методом дисків.

Бактерицидна дія різних хімічних речовин визначається за зоною затримки росту навколо папірців, змочених різними речовинами. Врахуйте результати антибіотикограми за допомогою лінійки (вимірюючи діаметр зони затримки росту). Результати занесіть до єдиного протоколу.

Рисунок 46 – Діаметр зони затримки росту пропорційний антибіотикочутливості мікроорганізму

г) Зробіть висновок про виділену чисту культуру.

Узагальніть результати дослідів з виділення чистої культури стафілокока зіслизової носа,напишіть висновок про роботу.

Зразок висновку: виділена із зіва культура бактерій за культуральними, морфологічними, тинкторіальними та ферментативними властивостями ідентифікована як Staphylococcus aureus. Виділений штам S. aureus ферментує маніт, має коагулазну активність і найбільш чутливий з антибіотиків до стрептоміцину (діаметр зони затримки росту 25 мм), з хімічних речовин – до генціанвіолету (діаметр зони затримки росту >20 мм).