Механізм цитотоксичної дії т-кілера на клітину-мішень

Рисунок 80 – Механізм цитотоксичної дії Т-кілера на клітину-мішень

17. Оцінка імунного статусу людини. Принципи функціонування імунної системи

Актуальність теми: визначення імунного статусу хворих, а також здорових людей необхідно проводити при підозрі на наявність імунодефіциту, а також у осіб, які будуть жити і працювати в екстримальних умовах.

Імунна система, як і інші системи організму, має свої особливості функціонування (роботи), які необхідно знати і брати до уваги лікарю в професійній діяльності.

Мета (загальна) – уміти оцінювати імунний статус людини та розпізнавати імунодефіцити, освоїти принципи функціонування імунної системи та особливості протиінфекційного імунітету.

Теоретичні питання

1. Імунний статус організму: визначення, принципи та показання для дослідження.

2. Двохетапний принцип оцінки імунного статусу.

Тести першого рівня (орієнтовні):

• клінічний аналіз периферичної крові. Відносна і абсолютна кількість лімфоцитів крові;

• визначення кількості Т- та В-лімфоцитів крові;

• визначення концентрації основних класів імуноглобулінів (M,G,A) у сироватці крові;

• визначення фагоцитарної активності лейкоцитів.

Тести другого (аналітичного) рівня:

• визначення субпопуляцій регуляторних Т-лімфоцитів (Т-хелперів, супресорних клітин);

• визначення спонтанної міграції лейкоцитів і тест гальмування міграції лейкоцитів з використанням ФГА;

• постановка тестів для оцінки гіперчутливості сповільненого типу на туберкулін та інші алергени, до яких існує сенсибілізація у більшості населення;

• дослідження проліферативної активності Т-лімфоцитів у реакції бласттрансформації на мітогени, антигени;

• визначення динаміки головних цитокінів, які регулюють клітинну і гуморальну імунну відповідь (ІНФ-γ, ФНП-α, ІЛ-2 та ІЛ-4, 5, 6, 10), а також модулюють запалення.

3. Принципи функціонування імунної системи.

4. Цілі і методи визначення стану гуморального та клітинного протиінфекційного імунітету.

5. Компоненти збудників (бактерій), які модифікують імунну відповідь (місце локалізації збудника, екзо- і ендотоксини, ферменти, пептидоглікани, капсула, імуноглобулінзв’язуючі білки, антигени та ін).

6. Механізми захисту мікроорганізмів від факторів імунітету.

Практична робота

Робота 1. Визначення загальної кількості Т-лімфоцитів (СДЗ) у забарвлених препаратах периферичної крові людини методом спонтанного розеткоутворення

Визначення загальної кількості Т- і В-лімфоцитів (СДЗ) у крові людини є одним із перших показників клітинного імунітету, який розглядається при вивченні стану клітинної ланки імунітету. Принцип реакції спонтанного розеткоутворення (Е-РОК) полягає в тому, що всі Т-лімфоцити людини мають на своїй поверхні рецептор (СДЗ),до якого можуть приєднуватись еритроцити крові вівці.Реакцію розпочинають з приготування суспензії овечих еритроцитів у поживному середовищі 199. Попередньо виділяють із досліджуваної крові суміш лімфоцитів. У центрифужній пробірці змішують рівні об'єми (по 0,5 мл) суспензії лімфоцитів і еритроцитів. Інкубують суміш при 37 °С (10 – 15 хв), центрифугують при 1000 обертів 1 хвилину і обережно ставлять пробірку у холодильник при 4 °С на 1 – 2 години. Осад обережно змішують, обертаючи пробірку навколо її осі у руках. Краплю суспензії вносять в камеру Горяєва та рахують під мікроскопом 100–200 лімфоцитів, які приєднали та не приєднали еритроцити. Розеткоутворючою клітиною вважається лімфоцит, який приєднав три та більше еритроцити. Для приготування мазків клітинну суміш наносять на знежирені предметні скельця, сушать при кімнатній температурі, фіксують глутаровим альдегідом, промивають водою і забарвлюютьзаРомановським-Гімзою.Узабарвлених препаратахлімфоцити мають фіолетовий, еритроцити – рожевий колір. У нормі в крові дорослих людей міститься 55–80% (800–2000) розеткоутворюючих лімфоцитів. Визначають відносну (%) і абсолютну (в 1 мл) кількість розеткоутворюючих лімфоцитів. Розетки необхідно знайти при мікроскопіюванні готового препарату і замалювати в протокол.

Рисунок 81 – Реакція спонтанного розеткоутворення

Робота 2. Провести облік результатів реакції бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ)

Для оцінки функціональної активності лімфоцитів проводять РБТЛ. Перехід лімфоцитів із спокійного стану (на мал. під номером 2,3,4) в бластні форми ( на мал. під номером 1), здатні до проліферації і подальшого диференціювання називають бласттрансформацією. Цей процес супроводжується морфологічними змінами лімфоцитів: збільшенням їх розмірів, кількості мітохондрій, рибосом. Бласти – великі (діаметром від 20 до 40 мкм) округлі клітини, в яких ядро займає більшу частину цитоплазми. Цитоплазма бластів зерниста, базофільна з зоною просвітлення навколо ядра. Під час трансформації у бласти в лімфоцитах відбувається інтенсивний синтез білка, РНК та ДНК. Процес закінчується мітотичним поділом клітини. РБТЛ може бути зумовлена специфічними та неспецифічними стимуляторами (мітогенами). Неспецифічним мітогеном рослинного походження є фітогемаглютинін (ФГА). Специфічними мітогенами є розчинні та корпускулярні антигени, які діють на Т-лімфоцити. Бласттрансформацію лімфоцитів вивчають у культурі лімфоцитів in vitro у стерильних умовах у середовищі 199. Оптимальна концентрація лімфоцитів складає 10⁶ на 1 мл середовища. Максимальна кількість бластів у культурі лімфоцитів виявляється через 2–4 доби після внесення мітогену. Під впливом ФГА трансформуються в бласти 70–80% лімфоцитів периферичної крові людини. РБТЛ відображає функціональну активність Т-клітин. За наявності апаратури та реактивів реакцію визначають радіометричним методом. Широко використовують РБТЛ у мікромодификації з радіоактивними ізотопами. Бласттрансформацію оцінюють за рівнем включення в ДНК лімфоцитів міченого тритієм тимідину (Н₃-тимідину). Результати відображають кількість імпульсів у хвилину за допомогою автоматичного сцинтиляційного лічильника. Інтенсивність РБТЛ можна також оцінювати морфологічно – прямим підрахунком бластів під мікроскопом у забарвлених препаратах. Бласти необхідно знайти при мікроскопіюванні готового препарату і замалювати в протокол.

Рисунок 82 – Реакція бласттрансформації лімфоцитів під дією мітогенів

Робота 3. Провести оцінку реакції гальмування (інгібіції) міграції лейкоцитів (РГМЛ)

Цей тест проводиться для вивчення функціональної активності сенсибілізованих Т-лімфоцитів, які при взаємодії зі специфічними алергенами (антигенами) продукують цитокін, який гальмує міграцію лейкоцитів у вогнищі запалення. Цей цитокін (хемокін) називається міграційно-інгібуючий фактор (МІФ). Площу міграції у досліді та контролі вимірюють під малим збільшенням мікроскопа і обчислюють індекс міграції за формулою ІМ =ПД/ПК, де ПД – площа зони міграції в досліді, ПК – площа зони міграції в контролі.

Робота 4.Вивчити зразки імунограми та зробити висновки:

Приклад 1. Визначити наявність вродженого імунодефіциту у чоловіка 55 років, якому впродовждвох років тричі досліджували вміст головних імуноглобулінів у периферичній крові. Результати дослідження наведені у табл. 4.

Таблиця 4 – Імунограма чоловіка 55 років

Приклад 1 Чоловік 55 років	Ig (г/л)
	А	М	G
а	0	2,7	30,3
б	0	1,9	39,0
в	0	2,1	28,5

Приклад 2. Визначити наявність вторинного імунодефіциту та можливість виникнення запального ускладнення після оперативного втручання у чоловіка віком 60 років з поліпозом прямої кишки (табл.5 ).

Таблиця 5 – Імунограма чоловіка 60 років

Приклад 2 Чоловік 60 років	L	Е	М	П	С	Л	Т	В	О	Тх	Тц	Фа	ШОЕ
До операції	4,3	3	1	2	71	23	71	13	16	61	10	21	11
2-га доба після операції	4,8	4	2	3	63	28	68	6	26	64	4	36	12
6-та доба після операції	4,0	2	1	1	68	27	54	6	40	50	4	30	11
Примітка: L – лейкоцити; Е- еозінофіли; М – моноцити; П – паличкоядерні; С – сегментоядерні; Л – лімфоцити; Т – лімфоцити; В – лімфоцити; О – лімфоцити, в яких рецептори заблоковані токсинами; Тх – Т-хелпери; Тц – Тцитотоксичні; Фа – фаза адгезії (фагоцитоз); ШОЕ – швидкість осідання еритроцитів