Пояснення до самостійної роботи з теми «ііі – IV етап виділення чистої культури аеробних бактерій. Ферменти бактерій. Антибіотики»

На чому ґрунтується біохімічна ідентифікація мікроорганізмів

Біохімічна ідентифікація ґрунтується на визначенні ферментів мікроорганізмів. Присутність ферментів визначають за їх здатністю розкладати відповідні субстрати, для такої ідентифікації необхідно 18 – 24 години

Міжнародна біохімічна класифікація ферментів залежно від каталізованої реакції

Згідно з міжнародною біохімічної класифікації ферментів залежно від каталізованої реакції виділяють 6 основних класів: оксидоредуктаз, трансферази, гідролази, ліази, ізомерази, лігази. Окремі представники кожного класу ферментів мають систематичну назву, традиційну (тривіальну) назву. Крім систематичної назви, ферменти мікроорганізмів мають традиційні назви, одержувані залежно від субстратної специфічності. Традиційно ферменти мікроорганізмів класифікуються на цукролітичні, протеолітичні, ліполітичні, окиснювально-відновні ферменти, а також ферменти-токсини, які визначають за допомогою спеціальних середовищ або тестів

Визначення біохімічної активності мікроорганізмів

Фермент (приклад)		Середовище для детекції	Позитивна реакція
ЦУКРОЛІТИЧНІ ФЕРМЕНТИ
Амілаза		Крохмальний агар (агар із 0,2% крохмалю) і розчин Люголя	При нанесенні розчину йоду на середовище з 18 – 24 годинною культурою мікроорганізмів, навколо колоній з амілазною активністю утворюється світлий незабарвлений ореол, у той час як інше середовище набуває синьо-фіолетового кольору через присутність в ньому крохмалю
Карбогідрази		Диференціально-діагностичні середовища для ентеробактерій (Ендо, Левіна, Плоскірєва та ін); містять лактозу, анілінові барвники	Лактозопозитивні ентеробактерії (Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, K. pneumonia) утворюють яскраво забарвлені червоні колонії, лактозонегативні ентеробактерії (Salmonella, Shigella) – блідо-рожеві або безбарвні колонії
		Полівуглеводні середовища (Кліглера, Олькеницького та ін.). Середовище Кліглера має малиново-червоний колір і містить: 0,1% глюкози, 1% лактози, солі Fe 2 +, феноловий червоний (індикатор рН).	При розкладанні глюкози жовтіє стовпчик середовища, при розкладанні лактози жовтіє скошена частина середовища, при розкладанні вуглеводів з утворенням CO2 у середовищі також з'являються газові пухирці або розрив стовпчика; при утворенні H2S спостерігається почорніння по ходу уколу
		Рідкі або напіврідкі моновуглеводні середовища Хісса; містять один із вуглеводів, індикатор рН; рН середовища встановлюють 7,2 ± 0,2. Для виявлення газоутворення в рідкі середовища вносять поплавок	При розкладанні вуглеводів утворюються кислі продукти, що знижують рН середовища, в результаті чого індикатор рН змінює колір. Газоутворення на рідких середовищах приводить до накопичення газу в поплавку, в напіврідких – появи розривів або газових пухирців у середовищі
Продукція ацетил-метил-карбінолу		Виявляють за допомогою реакції Фогес-Проскауера, використовують 10% КОН або 20% КОН.	Після додавання до культури однакового об'єму 10% або 20% КОН і інкубації впродовж 4 – 24 годин при 37 °С у разі утворення ацетилметилкарбінолу середовище забарвлюється в рожевий коліріз жовтим відтінком; у разі утворення ацетону і 2,3-бутиленгліколю забарвлення не змінюється
ПРОТЕОЛІТИЧНІ ФЕРМЕНТИ
Протеази та пептидази		5% знежирене молоко	Відбуваються згортання з утворенням згустків казеїну і пептонізація з лізисом казеїну, при якій молоко стає прозорим. Обидві реакції можуть відбуватися послідовно або одночасно
		Стовпчик желатину	Відбувається розрідження (желатин розріджують Proteus vulgaris, Bacillus anthracis)
Триптофаназа		М'ясопептонний бульйон або середовище з амінокислотою триптофан, а також індикаторний папірець, змочений щавлевою кислотою і закріплений під пробкою над поживним середовищем	Утворюється індол який спричиняє почервоніння папірця, змоченого щавлевою кислотою
Десульфурази (цистинази)		Середовища з цистеїном, метіоніном і якісним реактивом на H2S - солями заліза, свинцю, вісмуту	Утворюється H2S, який взаємодіє з Fe2 + (Pb2 +, Vi2 +) з утворенням сульфіду заліза чорного кольору, що викликає почорніння середовища
ЛІПОЛІТИЧНІ ФЕРМЕНТИ
Ліпаза	Жовтковий агар		Ліпази гідролізують жири на гліцерин і вільні жирні кислоти. Навколо колоній усвітлі на поверхні середовища видно райдужну плівку(схожа на бензинову плівку на поверхні води)
Лецитиназа	Жовтковий агар (до 300 мл стерильного МПА, розплавленого і охолодженого до 45 – 50 °С, додають джерело лецитину  жовток курячого яйця)		Лецитиназа розщеплює лецитин на фосфохолін і диглицерид, і навколо колоній з'являються опалесценцією зони, або «віночки помутніння»; лецитинази є у Staphylococcus aureus, клостридій, фузобактерій
ОКИСНЮВАЛЬНО-ВІДНОВЛЮВАЛЬНІ ФЕРМЕНТИ
Оксидаза		Фільтрувальний папір, змочений свіжоприготованим 1% розчином тетраметилпарафенілен-діаміну (реактив на оксидазу)	При нанесенні бакпетлей 18 – 24 годинної культури на поверхню фільтрувального паперу протягом 1 хв з'являється пурпурово-фіолетове забарвлення; використовують для диференціації Pseudomonas spр. (оксидазопозитивні) і ентеробактерій (оксидазонегативні)
Каталаза		3% розчин Н2О2; наявність каталази визначають у мікроорганізмів, вирощених на будь-якому поживному середовищі, крім кров'яних середовищ	При нанесенні на колонію перекису водню, або при внесенні культури в краплю перекису на предметному склі з'являються бульбашки газу; використовують для диференціації Streptococcus spр. (каталазопозитивні) і Staphylococcus spp. (каталазонегативні)
ФЕРМЕНТИ-ТОКСИНИ
Гемолізини		510% кров'яний агар	α-гемолізини призводять до неповного гемолізу з утворенням навколо колоній зони неповного просвітління середовища, яка впродовж 2–5 діб набуває зеленувато-бурого відтінку. -гемолізини викликають повний гемоліз з утворенням прозорої зони навколо колоній. -гемолізини не дають видимого оком гемолізу
О-стрептолізин		У пробірки з дворазовими розведеннями -гемолітичних стрептококів додають однаковийоб'єм 5% еритроцитів кролика, інкубують при 37 °С 1годину; паралельно ставлять контроль із суспензією еритроцитів у поживному бульйоні	У позитивних випадках відбувається гемоліз (лакова кров), унегативних випадках утворюється осад із еритроцитів. Визначають титр О-стрептолізину – найбільше розведення мікробної культури, при якому спостерігається гемоліз
Гіалуронідаза		Побірка з гіалуроновою кислотою і оцтова кислота; при додаванні до гіалуронової кислоти оцтової кислоти утворюється згусток муцину	Якщо тест-культура утворює гіалуронідазу, то після 15 хв інкубації культури бактерій при 37 °С у пробірці з гіалуроновою кислотою і додавання 2  3 крапель оцтової кислоти утворюється згусток муцину
Фібринолізин		Згустки фібрину	Розчинення згустків фібрину

Антибіотики (визначення)

Це хіміотерапевтичні препарати з хімічних сполук біологічного походження (природні), а також їх напівсинтетичні похідні та штучні аналоги, які в низьких концентраціях мають вибіркову пошкоджувальну або знешкоджувальну дію на мікроорганізми та пухлини

Емпіричне призначення антибіотиків

Ґрунтується на знаннях про природну чутливість бактерій до антибіотиків, епідеміологічних даних про резистентності мікроорганізмів у регіоні або стаціонарі. Безсумнівною перевагою емпіричної антимікробної терапії є негайний початок її проведення

Етіотропне призначення антибіотиків

Ґрунтується на виділенні збудника інфекції з клінічного матеріалу і визначенні його чутливості до антибіотиків

Хіміотерапія

Лікування інфекційних та інвазивних захворювань за допомогою хіміотерапевтичних препаратів

Хіміопрофілактика

Використання хіміотерапевтичних препаратів із метою профілактики інфекційних та інвазивних захворювань

Хіміопрепарати

Хімічні речовини, які вибірково діють на збудників інфекційних та паразитарних захворювань і нетоксичні для людини

Етіотропні антибіотики

Антибіотики, які мають високу вибірковість і активність щодо збудника

Класифікація антибіотиків за спектром дії

1. Антибіотики вузького спектра дії – активні щодо певної групи мікроорганізмів (приклади, бензин пеніцилін, еритроміцин тощо).

2. Антибіотики широкого спектра дії – пригнічують ріст і розмноження грампозитивних і грамнегативних типових і нетипових форм бактерій (приклади, цефалоспорини, фторхінолони тощо)

Класифікація антибіотиків

за спрямованістю біологічної дії

1. Протибактеріальні препарати.

2. Протигрибкові препарати.

3. Противірусні препарати.

4. Протипухлинні препарати

Класифікація антибіотиків

за механізмом дії

1. Антибіотики, які порушують синтез клітинної стінки мікробної клітини (Β-лактами, глікопептиди).

2. Антибіотики, які порушують функцію цитоплазматичної мембрани збудників (поліпептиди, полієни).

3. Антибіотики, які порушують синтез білків на рибосомах мікробних клітин (аміноглікозиди, тетрацикліни, макроліди, лінкозаміди).

4. Антибіотики, які порушують синтез нуклеїнових кислот (сульфаніламіди, хіноліни, рифаміцини)

Препарати першого вибору

Найбільш ефективні при певному виді інфекції, до яких чутлива більшість штамів даного збудника

Препарати другого ряду (альтернативні)

Препарати, які призначаються тоді, коли препарати першого ряду неефективні, або коли штам виділеного збудника більш чутливий саме до них

Препарати резерву

Препарати, які використовують в особливих випадках, наприклад, коли препарати першого та другого ряду неефективні або спричиняють ускладнення

Бактерицидні препарати

Згубно діють на мікроорганізми в концентраціях, які можна створити в макроорганізмі

Бактеріостатичні препарати

Пригнічують ріст і розмноження мікроорганізмів у концентраціях, які можна створити в макроорганізмі

Мінімальна інгібуюча (пригнічуювальна) концентрація антибіотика (МІК)

МІК  найменша концентрація антибіотика, яка пригнічує видимий ріст досліджуваного мікроорганізму в пробірці (в бульйонних або на агарових поживних середовищах) у стандартних умовах постановки досвіду і виражається в мкг / мл (мг / л) або ОД / мл

Мінімальна бактерицидна концентрація (МБК)

МБК  найменша концентрація антибіотика, яка при дослідженні в пробірці викликає загибель 99,9% мікроорганізмів від вихідного рівня впродовж певного періоду часу

Терапевтичний індекс

Це відношення максимальної дози, що переноситься хворим (Dosis toeranta – DT), до мінімальної лікувальної дози (Dosis curative – DC). Цей показник – DT:DC, не повинен були >3

Чутливий мікроорганізм

Штам мікроорганізму, який не має механізмів резистентності до даного препарату. Його ріст на поживному середовищі припиняється при використанні антибіотика терапевтичною дозою

Помірно-резистентний мікроорганізм

Штам мікроорганізму, ріст якого на поживному середовищі припиняється тільки при використанні антибіотика вищою дозою. Лікування інфекцій, спричинених помірно-резистентними мікроорганізмами, проводиться за відсутності альтернативних препаратів вищою (максимальною терапевтичною) дозою антибіотика

Резистентний мікроорганізм

Штам мікроорганізму, який має механізми резистентності до даного препарату. Його ріст на поживномусередовищі припиняється лише при використанні дуже високих концентрацій препарату, які не можна створити в організмі через їх високу токсичність. При лікуванні інфекцій, викликаних цим мікроорганізмом, клінічний ефект від терапії відсутній навіть при використанні вищої дози антибіотика. При цьому можуть спостерігатися побічні дії антибіотика

Етапи тестування чутливості мікроорганізмів до антибіотиків

1. Виділення чистої культури мікроорганізмів і приготування суспензії мікроорганізмів. Пряме визначення чутливості без виділення чистої культури можливе лише у виняткових випадках, при цьому дослідження слід повторити після виділення чистої культури мікроорганізму.

2. Приготування середовища.

3. Інокуляція середовища мікроорганізмами.

4. Інкубація.

5. Облік результатів, аналіз, формулювання рекомендацій з лікування.

6. Періодичний контроль якості тестування з використанням штамів із міжнародних колекцій мікроорганізмів

Методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків (стисла характеристика методів)

1. Диско-дифузійний метод. Напівкількісний метод, що визначає групи антибіотиків, активні відносно патогену.

2. Метод розведень в агарі. Кількісний метод, що визначає активні препарати та їх інгібуючі концентрації.

3. Метод розведень у рідких середовищах та Е-тест (епсилометричний метод). Кількісні методи, що визначають активні препарати та їх інгібуючі концентрації.

4. Автоматизований метод із використанням автоматичних мікробіологічних аналізаторів. Кількісний метод, який визначає активні препарати та їх інгібуючі концентрації, прогнозує механізми стійкості, дозволяє створювати комп'ютерну базу резистентності всіх досліджених культур до антибіотиків.

5. Генетичні методи, які дозволяють визначати генетичні маркери резистентності

Мікробіологічний принцип раціональної антибіотикотерапії

До призначення препарату слід установити збудника інфекції і визначити його індивідуальну чутливість до антимікробних хіміотерапевтичних препаратів. За результатами антибіотикограми хворому призначають препарат вузького спектра дії, що володіє найбільш вираженою активністю щодо конкретного збудника, дозою, що в 2–3 рази перевищує мінімальну інгібуючу концентрацію. Якщо збудник покищо невідомий, то зазвичай призначають препарати більш широкого спектра, активні щодо всіх можливих мікробів, що найбільш часто викликають цю патологію. Корекцію лікування проводять з урахуванням результатів бактеріологічного дослідження і визначення індивідуальної чутливості конкретного збудника (як правило, через 2–3 дні). Починати лікування інфекції потрібно якомога раніше (по-перше, на початку захворювання мікробів в організмі менше, по-друге, препарати активніше діють на мікробів, що ростуть і розмножуються)

Епідеміологічний принцип раціональної антибіотикотерапії

Вибір препарату, особливо для стаціонарного хворого, повинен ураховувати стан резистентності мікробних штамів, які циркулюють в даному відділенні, стаціонарі і навіть регіоні. Слід пам'ятати, що антибіотикорезистентність може не тільки купуватися, але й зникати, при цьому відновлюється природна чутливість мікроорганізму до препарату. Не змінюється тільки природна стійкість

Клінічний принцип раціональної антибіотикотерапії

При призначенні препарату враховують, наскільки безпечним він буде для даного пацієнта, що залежить від індивідуальних особливостей стану хворого (тяжкість інфекції, імунний статус, стать, наявність вагітності, вік, стан функції печінки і нирок, супутні захворювання тощо)

Ускладнення антибіотикотерапії з боку макроорганізму

І група ускладнень – токсичні реакції. Всі антибіотики мають ту чи іншу токсичну дію на організм. Ця дія залежить від властивостей самого препарату, його дози, способу введення, стану хворого. Серед ускладнень цієї групи на першому місці знаходиться ураження печінки. Гепатотоксичною дією володіють, наприклад, тетрацикліни, еритроміцин. Друге місце займають антибіотики з нефротоксичною дією, такі, як, наприклад, аміноглікозиди.

ІІ група ускладнень – дисбактеріоз. Під впливом антибіотиків широкого спектра дії (тетрацикліни, левоміцетин) відбувається якісна і кількісна зміна видового складу мікрофлори.

ІІІ група ускладнень – алергічні реакції. Алергічні реакції відображають індивідуальні властивості організму, а не фармакологічні особливості медикаменту. Проте частіше ці реакції виникають при повторних введеннях певних речовин, сенсибілізують організм, навіть при введенні мізерно малих кількостей (сотих і тисячних часток грама). Стан сенсибілізації може зберігатися багато місяців і років. Сенсибілізація може бути обумовлена і подібними за будовою хімічними речовинами («перехресна сенсибілізація»). Прикладом є перехресна сенсибілізація сульфаніламідами, стрептоміцином та пеніциліном.

Тривале застосування антибіотиків може спричинити ІV групу ускладнень – пригнічення імунореактивності

Резистентність мікроорганізмів

Це здатність мікроорганізмів розмножуватися за наявності терапевтичних концентрацій лікувальних препаратів

Біохімічні механізми формування та поширення резистентності мікроорганізмів до хіміотерапевтичних засобів

Біохімічні механізми резистентності діляться на 5 основних типів: ензиматична інактивація антибіотика (бета-лактамазами, аміноглікозидмодифікуючими ферментами); зміна структури внутрішньоклітинних мішеней; активне виведення (ефлюкс) антибіотиків із бактеріальної клітини, зниження проникності зовнішньої мембрани грамнегативної клітини; захист мішені

Методи вирішення проблеми антибіотикорезистентності

Застосування нових за хімічною структурою препаратів; комбінація антибіотиків із різними механізмами дії на клітину; заборона використовування у медичній та ветеринарній практиці антибіотиків, до яких у мікроорганізмів з'явилася резистентність у певному регіоні; визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків; заборона використовувати продукти харчування з залишковою кількістю антибіотика більшою від допустимих медикобіологічних норм