Индикация и идентификация вируса

ИФ. Её используют для быстрой индикации и идентификации АГ ВИГС в культуре кле­ток, инфицированных вирусным материалом, а также мазках-отпечатках, гистологических срезах патологического материла (фрагментов тонкого кишечника) от животных, естествен­но-больных или заболевших после экспериментального заражения. РИФ применяют в пря­мом и непрямом вариантах по общепринятым методикам. ИФ считается положительной при наличии в препаратах ярко-зеленого свечения клеток или цитоплазмы с ярко светящимися гранулами разного размера при отсутствии флюоресценции в контрольных препаратах. Свечение лейкоцитов и дегенеративно измененных клеток не учитывается. Выявление виру­са может быть успешным, если исследования проводятся на поросятах не поздн.ее чем через 24 ч после их заболевания. Наибольшее количество флюоресцирующих эритроцитов обнаруживают до и с наступлением диареи, позже число их невелико. Наиболее эффективным методом диагностики болезни оказалось исследование в РИФ замороженных срезов тощей кишки животных, убитых в период острой фазы заболевания. Одн.ако, по мнению других исследователей, метод мазков-отпечатков миндалин с помощью прямой РИФ превосходит исследования тощей кишки.

Для ИФ диагностики ИГС применяли меченый конъюгат против вирусного перитонита кошек. Такие конъюгаты готовили из перитонеальной жидкости больной кошки с титром AT в жидкости не ниже 1:2560. Конъюгат анти-ВИГС получают из иммунной сыворотки поросят, свободн.ых от патогенной микрофлоры, титр AT 1:256. При исследовании срезов слизистой оболочки тонкого кишечника поросят, зараженных вирусом, получены одинако­вые результаты с конъюгатом анти-ВИПК и анти-ВИГС равной интенсивности свечения. При исследовании с помощью конъюгата анти-ВИГС срезов селезенки кошек, зараженных ВИПК, получены отрицательные результаты. Это свидетельствует об одн.остороннем анти­генном родстве между этими вирусами. Таким образом, для диагностики ИГС можно с ус­пехом использовать конъюгаты анти-ВИПК. Поскольку наличие у кошек AT к вирусам сви­ней маловероятно, перитонеальная жидкость, полученная при заражении вирусом перитони­та, может служить хорошим препаратом для изготовления диагностического конъюгата. Конъюгаты к ВИГС, полученные из иммунной сыворотки поросят, могут давать неспецифи­ческую флюоресценцию.

Для диагностики ИГС ИФ в качестве источника AT предложено иммунное молозиво. Показано, что концентрация иммуноглобулинов в молозиве даже выше, чем в сыворотке крови. ИФ как метод диагностики имеет ряд проблем, главная из которых наличие перекре­стной реакции с ВИПК, КВС и РКВС. Поликлональные AT не дифференцируют ВИГС и РКВС, некоторые монАТ реагируют с ВИГС и не реагируют с РКВС. Такая дифференциа­ция может быть проведена как в ИФ, так и в ИФА (52, 111). РКВС обнаруживается в респи­раторных тканях и эпителиальных клетках носовой полости, но тем не менее для дифферен­циации необходимо использовать монАТ, поскольку ВИГС может также реплицироваться в указанных органах.

РН. При выделении вируса в культуре клеток его идентификацию проводят с помощью РН, используя 1000 ТЦДзо вируса и 20 нейтрализующих доз сыворотки. Помимо культуры клеток для идентификации вируса, изолированного в биопробе, ста­вят РН на восприимчивых поросятах в возрасте 1-5 дн..

ВИЭОФВ. Вирус ИГС образует 1-2 линии преципитации с гомологичными сыворотками и может быть легко выявлен в экстрактах из содержимого кишечника экспериментально зараженных поросят. Богатая АГ структура (наличие трех АГ с различ­ной электрофоретической подвижностью) позволила использовать для его обнаружения мо­дифицированную методику ВИЭОФ (двойной ВИЭОФ), повышающую результативность.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика

РН. Диагноз на прошедшую инфекцию обычно ставят при помощи РН в культуре кле­ток, определяя титры ВНА в сыворотках крови реконвалесцентов. Для этого используют по­стоянную дозу вируса (100-1000 ТЦД5о) и двукратные разведения испытуемой сыворотки, которую предварительно инактивируют 30 мин при 56°С. Для более точной диагностики лучше исследовать парные сыворотки, взятые с интервалом 3-4 нед.. Титры AT у перебо­левших животных могут колебаться от 1:8 до 1:1280. ВНА обычно появляются на 7-8-й день после заражения и циркулируют в крови 18 мес.. На 14-й день титр их у свиноматки, 3-дн. и 3- нед. поросят достигает 1:128 - 1:1024, a y отъемышей и откормочных свиней - 1:32 - 1:256. С 3-4 мес.. титр медленно снижается, через год он уже на 2-3 разведения ниже максимально­го. У некоторых свиноматок, наоборот, титр AT резко снижается. Колостральные AT o6ычно исчезают у поросят в возрасте 3-4 мес., и обнаруженные у животных в это время ВНА следует относить за счет инфекции.

Для выявления и титрования AT предложен микрометод РН с использованием микро­планшетов. Сначала готовят двукратные разведения исследуемых сывороток (от 1:4 до 1:256) в объеме 0,05 мл, затем во все лунки микропипеткой вносят по 0,05 мл вируса, со­держащего 100 ТЦД₅₀. После часовой инкубации при комнатной температуре во все лунки вносят по 0,05 мл суспензии клеток почек или щитовидной железы свиней в концентрации 300 тыс. клеток в 1 мл питательной среды, содержащей 30% инактивированной телячьей сыворотки. Пластины с культурой клеток выдерживают в термостате при 37°С в течение 4 дн. с 5% CO₂ . Контролем РН служат 8 лунок с незараженной культурой клеток. Реакцию учитывают через 48-96 ч при условии наличия ЦПД в лунках, инфицированных вирусом в разведении 10^-1 и 10^-2, и в лунках, инфицированных смесью вируса с отрицательной сыво­роткой, и при отсутствии ЦПД в лунках, инфицированных смесью вируса со специфической сывороткой, и в лунках, не зараженных вирусом. Положительными считают сыворотки, ко­торые в разведении не ниже 1:4 полностью нейтрализуют 100 ТЦД₅₀ вируса. Тест нейтрализации бляшкообразования более чувствителен, чем РН. Титр AT в нём ко­леблется от 1:100 до 1:5000, а в РН- 1:10 до 1:160.

РНГ. Используют для определения AT в парных сыворотках крови больных животных, а также для контроля за эпизоотическим состоянием племенных хозяйств-репродукторов в отношении гастроэнтерита. При этом у 5% поголовья 2 раза в год выборочно исследуют сы­воротку крови на наличие AT к вирусу. РНГА ставят в макро - и микровариантах по обще­принятой методике. Положительными считают сыворотки, которые в разведении 1:16 и выше вызывают агглютинацию эритроцитарного диагностикума. РНГА более чувствитель­на, чем PH. AT у заражённых поросят выявляются на 4-й день. РНГА используют как для подтверждения клинического диагноза, так и для выявления скрытых форм болезни и вирусоносительства. Реакция позволяет выявлять антитела к ВИГС в 2 раза чаще, чем РН. В бывшем СССР разработан эритроцитный диагностикум, с помощью которого можно вы­явить специфические AT у вакцинированных и больных ИГС.

ИФ. Описана модификация этого метода, обеспечивающая быстрое выявление и титро­вание AT к ВИГС. Сущность её заключается в приготовлении большого количества тефлонизированных стёклышек с лунками, содержащими АГ ВИГС. Их получают путём посева в лунки смеси инфицированных и неинфицированных клеток перививаемой линии свиных тестикулов. Стёклышки помещают в чашки Петри, которые инкубируют 16-18ч в термоста­те с газовой смесью воздуха, содержащей 5% CO₂. Около половины клеток в каждой лунке оказывались инфицированными вирусом, что обеспечивает контрастность, помогающую определить специфическую флюоресценцию в присутствии разной степени фонового окра­шивания. После фиксирования ацетоном стёклышки можно хранить до использования в НИФ при минус 20°С. Сравнение этой модификации с РН, показывает что по чувствитель­ности она не уступает, обладая рядом преимуществ: быстротой получения результатов (3 ч по сравнению с 4-6 да для РН); простотой постановки; значительно меньшим расходом культуры клеток; возможностью хранения полученных препаратов в замороженном состоя­нии в течение нескольких месяцев. Важным оказалось также то обстоятельство, что токсич­ность исследуемых сывороток, часто существенно осложняющая проверку их в РН, не явля­ется препятствием для получения результатов.

РДП. Позволяет выявлять AT к ВИГС. АГ в данной реакции служит щелочной экстракт содержимого кишечника поросят, зараженных ВИГС.

ELISA. Успешно используется для выявления и количественного определения сыворо­точных AT к ВИГС. При исследовании сывороток от поросят, инокулированных культуральным или кишечным ВИГС, ELISA выявлял AT к вирусу в среднем на 3 дня раньше, чем РН при исследовании проб сывороток от поросят, заражённых культуральным вирусом, и на 1 день раньше при обследовании сывороток от поросят, заражённых кишечным виру­сом, причём титры AT в ELISA превышают титры ВНА. Имеются и другие достоинства ELISA по сравнению с РН, в частности, на результаты реакции не влияет присущая некото­рым полевым сывороткам цитотоксичность. С 1981 г. этот тест в двух вариантах - косвен­ный и послойный (двухсэндвичный) - успешно используется в ветеринарной практике в Италии. Интересно, что с его помощью можно количественно оценивать Ig 3 классов: G, М и А.

РТГА. ВИГС обладает ГА активностью в отношении эритроцитов цыплят, морских свинок и КРС, но не агглютинирует эритроциты гусей и мышей. Наиболее высокие титры ГА отмечены при 4°С. Поскольку специфическая антисыворотка к вирусу ингибирует ГА, то для серодиагностики ИГС можно использовать РТГА. Титры гемагглютининов в свиных сыворотках коррелируют с титрами ВНА. РТГА с культуральным вирусным АГ ставят на физиологическом р-ре (рН 7,2) с эритроцитами морской свинки в концентрации 0,6% при температуре смеси 4°С, учёт реакции проводят через 1,5-2 ч. Установлена зависимость ГА активности вируса от его инфекционной активности. Определены оптимальные условия по­становки РТГА для обнаружения AT к вирусу ИГС в сыворотках крови свиней. Показана пригодность ее для исследования полевых материалов - сывороток крови и молока свинома­ток на наличие специфических к ВИГС AT. Выявлена корреляция между уровнем AT, вы­являемых в РТГА, и иммуноферментным методом.

Дифференциальная диагностика. В полиэтиологической структуре вирусных гастро­энтеритов свиней доминируют рота - и коронавирусы, вызывающие диарейный синдром. ИФА даёт возможность проведения широкого эпизоотологического анализа и дифферен­циации указанных болезней.