27. Принципы и методы экспресс-диагностики инфекционных заболеваний. Молекулярногенетические методы. Понятие о полимеразной цепной реакции (пцр), преимущества и ограничения метода.

Методы экспресс - диагностики: 1) ПЦР – метод, основанный на амплификации (увеличения количества копий) специфического гена возбудителя. Для этого двухнитевую ДНК вырезают из исследуемого материала, денатурируют и достраивают (при охлаждении) к расплетенным нитям ДНК новые комплиментарные нити. В результате данных операций из одного гена образуется 2. Этот процесс многократно повторяется при заданных температурных режимах до образования нужного количества копий необходимого гена.

Преимущества метода: 1) высокая специфичность и чувствительность; 2) высокая достоверность; 3) универсальность; 4) быстрота и информативность.

Недостатки ПЦР

Безусловно, ПЦР не идеальный метод, имеются и свои недостатки. Но они напрямую связаны с его достоинствами и с так называемым «человеческим фактором». ПЦР – очень высокотехнологичный метод, требующий соблюдения строжайших правил оснащения лаборатории. Достаточно сказать, что в помещении должен быть установлен фильтр биологической очистки со степенью 99,9%. Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов, и в процессе подготовки к проведению реакции образец может быть загрязнен — возможно «ложное срабатывание».

Оценивать результаты ПЦР должен практический врач, который лечит конкретного больного. Дело в том, что далеко не всегда положительный ответ ПЦР означает наличие заболевания. Например, человек пролечился от какого-либо заболевания, но погибший и уже не опасный возбудитель будет еще некоторое время «разбираться на запчасти» защитной системой организма. Если в этот момент сделать ПЦР – результат окажется положительным.

Другой вариант – это отрицательный результат ПЦР при наличии даже явной клинической картины. Одна из наиболее возможных причин – материал для исследования был взят «не оттуда». Образец должен брать квалифицированный врач, строго следуя инструкции, которую ему дает лаборатория.

2) Иммуноферментный анализ (ИФА). В основе метода лежит выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, коньюгированных с ферментом-меткой. Специфический антиген адсорбируют на поверхности лунок в пластинках из полимерного материала, фиксированный на пластинке антиген инкубируют с испытуемыми человеческими сыворотками. После отмывания от несвязавшихся белков связанные иммобилизированными антигенами Ig выявляют с помощью антивидовой иммуноблоттинговой сыворотки, антителам которой прикреплён фермент (пероксидаза). После инкубации с субстратом и индикотором (диаминобензидином) оценивают ферментативную активность по интенсивности окраски.

3) Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод Кунса)

Различают разновидности методов: 1.Прямой – основан на том, что антигены тканей или микробов способны светиться под УФ-излучением; 2.Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой сыворотки, меченной флюорохромом; 4) Радиоиммунный анализ (РИА). Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом.

5) Иммуноблоттинг – высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИФ. Используют, как метод диагностики при ВИЧ.

6) Реакции иммобилизации (трепонем, холерных вибрионов) применяется при диагностике заболеваний, возбудителем которых являются подвижные бактерии. Для этого материал, взятый у больного обрабатывают специфическими сыворотками – если реакция положительна - наблюдается иммобилизация бактерий на стекле.

7) Газожидкостная хроматография (ГЖХ) Этот метод является высокоэффективным методом обнаружения анаэробных бактерий, которые в процессе своей жизнедеятельности выделяют летучие жирные кислоты (изомасляная, масляная, валериановая, изовалериановая, капроновая). Для проведения этого анализа проводят экстракцию ЛЖК летучим органическим растворителем, после чего полученный экстракт вводят в хроматограф.