28. Иммунохимический анализ. Задачи иммунохимического анализа. Серотипирование и серодиагностика. Реакции биологической нейтрализации.

(см. методичку)

Контакты между антигенами и антителами высоко специфичны и приводят к образованию иммунных комплексов («комплекс антиген-антитело»). Это специфические взаимодействия лежат в основе ИХА. Подобные реакции также называют серологическими, поскольку антитела для их постановки получают из сыворотки. ИХА применяют в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

Виды постановки иммунохимических реакций, используемых в диагностике:

Серотипирование – идентификация микробных антигенов при помощи известных антител. Используется диагностическая сыворотка.

Серодиагностика – выявление антител в сыворотке пациента с помощью известного антигена. Используется диагностикум.

Реакция нейтрализации

Принцип реакций, основанных на феномене биологической нейтрализации, следующий: антитело, связываясь с антигеном-белком, нейтрализуют биологическое действие белка (например, бактериального токсина или рецептора вируса).

1. Нейтрализация бактериального токсина.

Используется для определения типа бактериальных токсинов, имеющий выраженный биологический эффект на организм человека и чувствительных животных (столбнячный и ботулинический токсины). Для постановки реакции материал, содержащий экзотоксин (центрифугат чистой культуры возбудителя или пищевые остатки, содержащие бактериальный токсин), смешивают с антитоксической сывороткой, и после 30 минут экспозиции вводят лабораторным животным (чаще всего используют белых лабораторных мышей или морских свинок). Если в контроле животным вводят токсин без сыворотки. Если в материале присутствовал сильный биологический токсин – животное погибает через полчаса после инъекции. При инкубации токсин in vitro с соответствующей ему по типу антитоксической сывороткой образуется иммунный комплекс и происходит нейтрализация токсина (белок в составе иммунного комплекса теряет свои токсические свойства вследствие изменений третичной структуры молекулы). Поэтому, в случае инъекции иммунного комплекса животное не погибает.

2. Реакция торможения гемагглютинации.

Применяется для типирования вирусов (или обнаружения антител к вирусам), имеющих поверхностные белки-гемагглютинины, обладающие способностью склеивать эритроциты животных. Специфические противовирусные антитела могут блокировать гемагглютинины (РТГА). РТГА ставят в лунках полистероловых планшетов. Антивирусную сыворотку вносят в лунку вместе с взвесью вируса. После непродолжительной инкубации добавляют в лунки взвесь эритроцитов курицы. Если тип сыворотки и тип вируса совпадают, то антитела блокируют антигены вируса и интактные эритроциты оседают на дне в виде «пуговки». Таким образом, при положительной РТГА гемагглютинация отсутсвует.

3. Нейтрализация цитопатического действия вирусов.

Реакцию используют для идентификации вирусов (например, вирус полиомиелита), обладающих выраженным цитопатическим действием (ЦПД). Реакцию можно также применять выявления антител к цитопатическому вирусу Принцип нейтрализации ЦПД вируса заключается в следующем6 рецепторы вируса (антигены) можно заблокировать с помощью специфичкских антитл. В этом случае вирус теряет способность адсорбироваться на пермиссивной клетке и цитопатический эффект не наблюдается. Тестирование проводят с помощью так называемой «цветной пробы», которая основана на учете изменения красного цвета питательного среды. Цветная проба ставится в пробирках с жидкой питательной средой, содержащий индикатор феноловый красный. Жидкая среда необходима для роста и размножения культуры клеток. Под влиянием продуктов метаболизма живых клеток, pH среды изменяется в кислую сторону, и она обретает желтый цвет. Если клетки были инфицированы вирусом с выраженным цитопатическим эффектом, то клеточная культура погибает. В этом случае цвет среды остается неизменным, т.е. красным.

С помощью цветной пробы учитывается способность противовирусных антител блокировать адгезию вируса на клетке и, следовательно, нейтрализовать цитопатический эффект вируса. При нейтрализации ЦПД вируса питательная среда остается желтой, что указывает на сохранение жизнеспособности культурой клеток.