15. Принципы и методы культивирования бактерий. Условия, влияющие на рост и размножение бактерий. Ростовые факторы. Питательные среды и их классификация. Работы р. Коха.

Принципы культивирования бактерий:

1. Питательность. Они должны содержать вещества, причем находящиеся в легко усвояемом виде, необходимые микроорганизмам для питания и пополнения энергии. К ним относят органогены и минеральные вещества. Для некоторых микроорганизмов дополнительно необходимы витамины и аминокислоты, которые они не могут синтезировать.

2. Оптимальный уровень рН. Он влияет на проницаемость клеточной оболочки и, соответственно, на возможность усвоения питательных веществ бактерией. Чаще всего значение водородного показателя должно быть на уровне 7,2–7,4. Многие микроорганизмы в ходе своей жизнедеятельности вырабатывают продукты с кислой или щелочной реакций, и для того, чтобы рН питательной среды не изменялся, она должна обладать буферностью.

3. Изотоничность. Осмотическое давление в питательной среде для культивирования бактерий должно иметь те же значения, что и внутри микробных клеток. Обычно оно соответствует 0,5 % раствору NaCl.

4. Стерильность. Связано это с тем, что появление посторонних бактерий исказит результаты изучения анализируемого штамма.

5. Уровень влажности. Этот показатель наряду с консистенцией среды должен иметь оптимальные характеристики для конкретного вида бактерий.

6. Окислительно-восстановительный потенциал (RH2). Он показывает соотношение веществ, которые отдают и которые принимают электроны, а также уровень насыщения кислородом питательной среды. Для аэробов и анаэробов условия культивирования бактерий несколько разнятся по данному показателю. Анаэробные микроорганизмы лучше всего размножаются при значениях RH2, не превышающих 5, а аэробные – не менее 10.

7. Унифицированность. Важно, чтобы питательная среда содержала неизменные количества отдельных ее ингредиентов. Кроме того, предпочтительны прозрачные растворы, на которых легче отслеживать рост культуры или заметить ее загрязнение.

Методы: 1.Поверхностные и глубинные; 2.Периодические и непрерывные (в жидкой среде); 3.Аэробные и анаэробные;

1. Поверхностные выращивают на:

а) плотной поверхности, кислород из воздуха. б) жидкой поверхности, тогда бактерии растут плёнкой. в) на сыпучей поверхности получают ферментные препараты.

Глубинные в жидкой среде – растворенный в воде кислород – помутнение среды.

2. Периодические: весь объем среды засевают чистой культурой и выращивают в оптимуме. Культура проходит 4 стадии развития: 1. Лаг-фаза (приспособление к окружающей среде); 2. Лог-фаза (размножение); 3. Стационарная; 4. Отмирание;

Непрерывные - это такое культивирование, когда в среду постоянно притекают питательные вещества, поэтому не происходит стадии отмирания. Это позволяет продержать культуру долго в активном состоянии.

3. Аэробное – использование кислорода при питании.

Анаэробное – не используют кислород при питании. Облигатные анаэробы НЕ имеют ферментов для инактивирования активных форм О₂ (Н₂О₂ – перекись водорода – пероксидаза). Это является основной причиной гибели анаэробов в присутствии О₂.

Создание анаэробиоза:

Физический метод	Свечку ставят вместе с чашкой Петри под колпак. Когда свеча тухнет – значит О2 выжжен.
Химический метод	АНАЭРОСТАТ ГАСПАК. Гаспак – герметичный пакет с химическими веществами (лимонная кислота, Na2CO3)+ катализатор. Вода + ГАСАК = забирают О2 и синтезируют СО2
Биологический метод	МЕТОД ФОРТНЕРА. Вырезают полоску агара и на 1 половину селят аэробов, на 2-ю анаэробов. Аэробы съедят СО2 и тогда начнут расти анаэробы. + В термостат на 18-24 часа + 37 градусов.
Специальные питательные среды	ЖИДКАЯ СРЕДА КИТТА-ТАРОЦЦИ и АГАР ВИЛЬСОНА-БЛЕРА. + сверху слой вазелинового масла. Внутри среда содержит аскорбиновую кислоту, глюкозу, кусочек мяса.

Принципы классификации питательных сред:

1. По происхождению:

Искусственные	Естественные
- из продуктов животного (молоко, яйца, сыворотка) и растительного (отвары злаков, дрожжей, риса) происхождения, или чаще используют сухие питательные среды, которые изготавливают в промышенных масштабах – гидролизаты непищевых продуктов (рыбные отходы). Достоинство: стандартный состав и удобство в транспортировке и могут долго храниться	- кровь, сыворотка, желчь

1. По консистенции:

   Жидкие	Плотные	Полужидкие
   - питательный бульон, пептоная вода, сахарный бульон, желчный бульон	- готовят путем добавления к жидкой среде + 1,5-2% агара.	- готовят путем добавления к жидкой среде 0,3-0,7% агара

2. По составу:

Простые	Сложные
Применяются для выращивания МНОГИХ микробов. К простым средам относятся МЯСО-ПЕПТОННЫЙ БУЛЬОН, МЯСО-ПЕПТОННЫЙ АГАР.	Специальный тип среды	Они СОДЕРЖАТ СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА, которые удовлетворяют пищевые потребности более требовательных патогенных бактерий. Например, КРОВЯНОЙ АГАР, СЫВОРОТОЧНЫЙ АГАР, САХАРНЫЙ БУЛЬОН.
	Элективный, селективный тип среды	Содержит вещества, создающие ОПТИМАЛЬНЫЕ УЛОВИЯ ДЛЯ МИКРОБОВ ОПРЕДЕЛЕННОГО ВИДА И ИНГИБИРУЮЩИЕ РОСТ СОПУТСВУЮЩЕЙ МИКРОФЛОРЫ. Например, ЖЕЛТОЧНО-СОЛЕВОЙ АГАР (для выращивания стафилококков) или жидкая среды ЩЕЛОЧНОЙ БУЛЬОН (для культивирования Vibrio cholerae).

Ростовые факторы– необходимые в малых количествах вещества, которые микроорганизм не способен синтезировать самостоятельно.

Группы факторов роста: 1.Пурины и Пиримидины ( для синтеза нуклеиновых кислот ) 2.Незаменимые аминокислоты (для синтеза белка) 3.Витамины (коэнзимы и функциональные группы некоторых ферментов)

Прототроф - бактерии, не требующие ростовых факторов извне.

Ауксотроф- бактерии, нуждающиеся в факторах роста.

Работы Р.Коха:

• Открыл бациллу сибирской язвы, туберкулезную палочку и холерный вибрион;

• Способ окраски бактерий анилиновыми красителями;

• Ввел в практику чашки Петри (метод выделения чистых культур на твердых питательных средах);

• Идентификация патогенной микрофлоры (триада Генле-Коха): выделение микроорганизма, затем получение чистой культуры, в конце – заражение лабораторного животного;

16. Энергетический метаболизм бактерий (КАТАБОЛИЗМ). Фототрофы и хемотрофы. Разновидности хемосинтеза (дыхание, брожение). Облигатные аэробы и анаэробы, их разновидности. Факультативные анаэробы. Эффект Пастера. Принципы культивирования облигатных анаэробов.

Энергетический метаболизм бактерий (катаболизм) – это совокупность реакций окисления различных восстановленных органических и неорганических соединений, сопровождающихся выделением энергии.

Фототрофы - это организмы, которые используют свет для получения энергии.

Хемотрофы - организмы, получающие энергию в результате хемосинтеза — окислительно-восстановительных реакций, в которых они окисляют химические соединения, богатые энергией. Хемосинтезирующие бактерии — бактерии, использующие диоксид углерода в качестве единственного источника углерода.

Хемосинтез – синтез органических веществ из Неорганических с использованием энергии окисления химических веществ.

ДЫХАНИЕ – процесс получения энергии путем перевода энергии химических связей питательных веществ в АТФ, конечным акцептором электронов в котором является НЕОРГАНИЧЕСКОЕ вещество. БРОЖЕНИЕ – процесс получения энергии путем перевода энергии химических связей питательных веществ в АТФ, конечным акцептором электронов в котором является ОРГАНИЧЕСКОЕ вещество.

Отношения к кислороду

Аэробы облигатные (1)	Анаэробы облигатные (2)	Факультативные анаэробы (3)	Микроаэрофилы (4)	Аэротолеранты (5)
- кислородное дыхание - гибнут без О2 - размножаются плёнкой на поверхности питательной среды в колбе	- брожение - гибнут при О2 - размножаются в виде осадка	-используют 2 типа хемосинтеза, способны переключаться с дыхания при О2 на брожение при его отсутствии - размножаются в виде равномерного помутнения среды	- кислородное дыхание - при высоких концентрациях О2 гибнут, лучше растут если большая концентрация СО2	-брожение или анаэробное дыхание - устойчивы к О2, растут при его присутствии, но НЕ используют как источник энергии
Примеры
Mycobacterium tuberculosis	Clostridium tetani	Escherichia coli	Спирохеты	Streptococcus pyogenes

Принципы культивирования облигатных анаэробов. Облигатные анаэробы НЕ имеют ферментов для инактивирования активных форм О₂ (Н₂О₂ – перекись водорода – пероксидаза) = основная причина гибели анаэробов в присутствии О₂ Создание анаэробиоза достигается:

Физический метод	Свечку ставят вместе с чашкой Петри под колпак. Когда свеча тухнет – значит О2 выжжен.
Химический метод	АНАЭРОСТАТ ГАСПАК. Гаспак – герметичный пакет с хим веществами (лимонная кислота, Na2CO3)+ катализатор. Вода + ГАСАК = забирают О2 и синтезируют СО2
Биологический метод	МЕТОД ФОРТНЕРА. Вырезают полоску агара и на 1 половину селят аэробов, на 2-ю анаэробов. Аэробы съедят СО2 и тогда начнут расти анаэробы + В термостат на 18-24 часа + 37 градусов.
Специальные питательные среды	ЖИДКАЯ СРЕДА КИТТА-ТАРОЦЦИ и АГАР ВИЛЬСОНА-БЛЕРА. + сверху слой вазелинового масла. Внутри среда содержит аскорбиновую кислоту, глюкозу, кусочек мяса.

Эффект Пастера – снижение потребления глюкозы и прекращение продукции молочной кислоты клеткой в присутствии кислорода.