30. Иммунохимические реакции на основе меченых антител. Иммуноферментный анализ. Иммуноблотинг.

(см. методичка)

Иммунохимические реакции на основе меченых антител.

Принцип этих реакций следующий: антигены или антитела могут быть определены с помощью меченных антител (иммуноглобулинов) – конъюгатов. В качестве метки можно использовать ферменты, флюорохромы и радиоактивные материалы. Этот метод более чувствителен по сравнению с другими серологическими реакциями, с его помощью можно обнаружить исследуемые компоненты даже в ничтожной концентрации.

1. Иммуноферментный анализ.

Прост и высокочувствителен. В качестве метки антител используется фермент (пероксидаза, щелочная фосфатаза, галаксидаза). Активность ферментов измеряется добавлением специфического субстрата (например, перекись водорода) и индикатора. В присутствии фермента субстрат разлагается, и индикатор изменяет окраску. В контрольных пробах жидкость остается прозрачной или слегка желтоватой, в опятных лунках при положительных результатах – желто-коричневый цвет жидкости различной интенсивности, иногда даже происходит почернение. Эти изменения фиксируются визуально или колориметрически. Каждую пробу оценивают спектрофотометрически относительно контроля. Активность фермента пропорциональна количеству связавшегося конъюгата и, соответственно, числу образовавшихся иммунных комплексов.

Разработаны различные варианты ИФА. Наиболее известен твердофазный метод, основанный на иммобилизации (сорбции) первого компонента реакции на твердо носителе (плоское дно лунок полистероловых или поливиниловых планшеток). Исследуемый субстрат (сыворотка крови, испражнения и т.д.) всегда является вторым компонентом, который добавляется в лунки планшета с иммобилизированными молекулами.

2. Иммуноблотинг.

Иммуноблоттинг является сочетанием методов электрофореза и иммуноферментного анализа. Собственно блотингом называют перенос молекул на твердую подложку, т.е. матрицу, способную их иммобилизировать (связывать). Электрофорезический перенос биомолекул из полиакриламидного геля на матрицу называется электроблотингом, и его сочетание с последующим выявлением иммобилизированных на матрице молекул при помощи меченных антител – иммуноблотингом.

А) На первом этапе иммуноблотинга происходит разделение белковой смеси с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Электрофорез позволяет выполнить фракционирование исследуемого материала, разделив его на белковые фракции по молекулярной массе, передвигающиеся с различными скоростями при пропускании через раствор электрического тока.

В) На втором этапе осуществляется электрофоретический перенос белков, разделенных в геле микропористую мембрану, выполняющую функцию матрицы, которую разрезают на полоски (стрипы). При этом отрицательно заряженные белки перемещаются в направлении от анода к катоду при помощи электрического поля и сорбируются матрицей.

С) После переноса белков, меьрану обрабатывают специфическими антителами к иммобилизированным белкам. Далее, образовавшиеся на матрице иммунные комплексы обрабатывают конъюгатом, и затем смесью субстрата и индикатора. После промывания мемьраны от несвязавшихся компонентов, на ней визуально обнаруживаются окрашенные полосы, соответствующие местам иммобилизации анализируемых белков на матрице. Количество и распределение полос на матрице, инкубируемой с сывороткой пациента, сравнивается с положительным контролем, т.е. матрицей, на которой имеется полный набор полос, то есть весь спектр антител, соответствующих белкам вируса. Иммуноблотинг применяют для подтверждения наличия в сыворотке у больного антител к ВИЧ.