17. Молекулярные механизмы ферментативного катализа.

Ответ. Механизмы ферментативного катализа определяются ролью функциональных групп активного центра фермента в химической реакции превращения субстрата в продукт. Выделяют 2 основных механизма ферментативного катализа: кислотно-основной катализ; ковалентный катализ. Концепция кислотно-основного катализа объясняет ферментативную активность участием в химической реакции кислотных групп (доноры протонов) и/или основных групп (акцепторы протонов). Кислотно-основной катализ - часто встречающееся явление. Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства как кислот, так и оснований. К аминокислотам, участвующим в кислотно- основном катализе, в первую очередь относят цистеин, тирозин, серин, лизин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, гистидин. Радикалы этих аминокислот в протонированной форме - кислоты (доноры протона), в депротонированной - основания (акцепторы протона). Благодаря этому свойству функциональных групп активного центра ферменты становятся уникальными биологическими катализаторами, в отличие от небиологических катализаторов, Примером кислотно-основного катализа, в котором кофакторами являются ионы Zn2+, а в качестве кофермента используется молекула NAD+, можно привести фермент алкогольдегидрогеназу печени, катализирующую реакцию окисления спирта: С2Н5ОН + NAD+ → СН3-СОН + NADH + H+. Ковалентный катализ основан на атаке нуклеофильных (отрицательно заряженных) или электрофильных (положительно заряженных) групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом или функциональной группой аминокислотного остатка (как правило, одной) активного центра фермента. Действие сериновых протеаз, таких как трипсин, химотрипсин и тромбин, - пример механизма ковалентного катализа, когда ковалентная связь образуется между субстратом и аминокислотным остатком серина активного центра фермента. Термин "сериновые протеазы" связан с тем, что аминокислотный остаток серина входит в состав активного центра всех этих ферментов и участвует непосредственно в катализе. Рассмотрим механизм ковалентного катализа на примере химотрипсина, осуществляющего гидролиз пептидных связей при переваривании белков в двенадцатиперстной кишке. Субстратами химотрипсина служат пептиды, содержащие аминокислоты с ароматическими и циклическими гидрофобными радикалами (Фенилаланин, Тирозин, Триптофан), что указывает на участие гидрофобных сил в формировании фермент-субстратного комплекса.

18. Способы определения активности фермента. Единицы измерения. Понятие об удельной и молярной активности.

Ответ. Для определения ферментативной активности используют следующие методы. Химический метод – количественное определение субстрата или продуктов с помощью химических реагентов (О-гликозилгидролазы – по образованию восстанавливающих сахаров). Спектрофотометрический метод – измерение скорости ферментативной реакции по изменению поглощения субстрата при характеристической длине волны (лиазы – по образованию двойной связи). Манометрический метод – определение количества газа, выделяющегося в процессе реакции (оксидазы – по поглощению О2, декарбоксилазы – по выделению СО2). Поляриметрический метод – фиксируется изменение оптического вращения (β-фруктофуранозидаза). Хроматографический – количественное определение субстрата или продуктов с помощью различных видов хроматографии: бумажной (анализ сахаров), тонкослойной (гликозидов со сложными агликонами), ВЭЖХ (аминокислотный анализ и др.). Катал — это количество фермента, которое обеспечивает превращение 1 моля субстрата в продукт за 1 секунду. Стандартная единица (U) — это количество фермента, которое превращает 1 мкмоль субстрата в продукт за 1 минуту. 1 U = 16,67 нкатал (нанокатал). В медицине активность ферментов выражают чаще всего в единицах активности на 1 л биологической жидкости. Удельная активность — выражается в единицах активности, рассчитанной на единицу массы белка (чаще всего на 1 мг). Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Количество молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято называть числом оборотов фермента, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в 1 с 44000 молекул перекиси водорода. Принципы определения активности ферментов: по скорости исчезновения субстрата; по скорости накопления продуктов реакции.