10. Влияние температуры, pH и концентрации фермента на скорость ферментативной реакции.

Ответ. Влияние количества субстрата: Кm - это концентрация субстрата, при которой скорость химической реакции составляет 1⁄2 от максимально возможной. Km для каждого энзима величина постоянная, она отражает сродство энзима и субстрата; Кm гексокиназы=0,1 мМ ⁄л, Кm глюкокиназы=10 мМ ⁄л. Биологических смысл различного сродства (Кm) гексокиназы и глюкокиназы к глюкозе и распределения этих ферментов по тканям (сохранение гомеостаза глюкозы). Количество фермента. Зависимость прямо пропорциональная, т.е. чем больше фермента в клетке, тем выше скорость ферментативной реакции. Количество энзима в клетке зависит от ее потребности в ферменте (гипотеза Жакоба и Моно. В покое в клетке функционирует лишь небольшая часть энзимов. В ситуации стресса в кинетике химической реакции участвует максимальное количество энзимов, что обеспечивает адаптацию клетки к экстремальным условиям. При увеличении температуры до 40С скорость ферментативной реакции возрастает (повышение температуры на 10С увеличивает скорость реакции в 1,5-2 раза), возрастание скорости ферментативной реакции при повышении температуры используется организмом как защитный механизм, понижение температуры (гипотермия организма и его отдельных тканей) используется в медицине для замедления ферментативных реакций при консервации органов и выполнении хирургических операций на «сухом» органе. Выше 40С скорость некоторых ферментативных реакций замедляется, т.к. начинается денатурация фермента. Каждый фермент проявляет максимальную активность при оптимальном для него значении рН среды. Оптимум рН среды для большинства ферментов лежит в нейтральной среде. Имеются исключения: пепсин – оптимум рН=1,5-2, щелочная фосфатаза – оптимум рН=9-10. Изменение рН в организме при патологиях нарушает функцию энзимов (изменяется степень ионизации функциональных групп активного и аллостерического центров и их архитектоника).

11. Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции. Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен.

Ответ. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата носит гиперболический характер. При постоянной концентрации фермента скорость реакции постепенно увеличивается достигая максимума; когда дальнейшее увеличение концентрации субстрата уже не влияет на скорость реакции, в этом случае говорят, что фермент насыщен, а субстрат в избытке. Михаэлис и Ментен предположили, что механизм ферментативных реакций описывается моделью: В которой скорость реакции определяется распадом фермент-субстратного комплекса, v0 = k2(ES). Модель предполагает, что равновесие между свободными ферментом, субстратом и фермент-субстратным комплексом устанавливается быстро по сравнению со скоростью реакции (быстро устанавливающееся равновесие, k2<< k1, k-1). В этом случае вторая стадия реакции практически не влияет на первую, и для выражения концентрации фермента можно воспользоваться константой диссоциации. Ks=(E)*(S)/(ES) ОТСЮДА (E)= Ks*(ES) /(S). Общая концентрация фермента в реакционной смеси выражается уравнением материального баланса [E]0 = [E] + [ES] = [ES] (KS/[S] + 1). Тогда концентрация фермент-субстратного комплекса равна: [ES] = [E] 0*[S] / KS + [S]. Это уравнение соответствует изотерме адсорбции Ленгмюра, показывая, что фермент действует как гетерогенный катализатор. Реакция достигает максимальной скорости, когда весь фермент находится в комплексе с субстратом Vmax= k2[ES]max = k2[E]0. Это условие выполняется, если реакция протекает при избыточной концентрации субстрата: [S]0>>[E]0. Из уравнений следует: Это и есть классическое уравнение Михаэлиса-Ментен, которым и сегодня пользуются для описания кинетики ферментативных процессов. Михаэлис и Ментен вывели уравнение с учетом двух предположений (быстро устанавливающееся равновесие и избыток субстрата). Позднее было показано, что уравнение справедливо, то есть хорошо описывает реакцию, при выполнении всех следующих условий. 7 Основных постулатов для выполнения уравнения Михаэлиса-Ментен. В ходе реакции образуется кинетически устойчивый фермент-субстратный комплекс. Определяемая с помощью уравнения константа Кs является константой диссоциации фермент-субстратного комплекса: это справедливо, только если k2<< k1, k-1. Концентрация субстрата не меняется в ходе реакции, то есть [S] = [S]0. Продукт реакции быстро отщепляется от фермента, то есть реакция двухстадийная. Вторая стадия реакции необратима. Так как это практически не выполнимо, мы принимаем во внимание только начальные скорости. C каждым активным центром фермента связывается только одна молекула субстрата. Для всех реагирующих веществ вместо активностей можно использовать их концентрации При формулировке кинетического выражения для скорости ферментативной реакции Михаэлис и Ментен сделали три допущения: 1) Стационарное состояние реакции в момент равновесия, когда скорости образования и расходования ES равны; 2) Весь фермент в условиях насыщающих концентраций субстрата превращается в энзимсубстратный комплекс ES; 3) Если весь фермент в виде ES, то скорость реакции максимальна и Vmax=k2[ES]. Образование ES: [ES]=k1[S][E] (I) Расходование ES: [ES]=k-1[ES]+k2[ES] (II) Приравнивая выражения (I) и (II) и сокращая обе части на k1 получаем: [S][E] = [ES](k-1 + k2)/k1 = [ES]Km, где Km = (k-1 + k2)/k1 Выразим равновесную концентрацию [E] через начальную [Eo]: [E] = [Eo] - [ES] [S]([Eo]-[ES])= [ES]Km, переносим [S] в правую часть выражения и делим обе части на [ES]: [Eo]/[ES]=Km/[S]+1= (Km+[S])/[S] (III) Поскольку трудно (если не невозможно) измерить [ES], произведем замену с учетом того, что в насыщающих концентрациях [S] весь [Eo] перейдет в [ES] и максимальная скорость при этом будет равна Vmax=k2[ES]=k2[Eo]. В это же время скорость реакции равна V=k2[ES]. Через отношение этих скоростей выразим [Eo]/[ES]: V/Vmax= [ES]/[Eo] В уравнении (III) произведем замену отношения [Eo]/[ES] на Vmax/V и получаем: V = Vmax[S]/(Km+[S]) Это и есть уравнение Михаэлиса-Ментен.