Определение фурфурола

Для определения фурфурола в коническую колбу вместимостью 250 см³ отмеряют цилиндром 100 см³ дистиллята. Для контрольного титрования берут 100 см³ 12%-й соляной кислоты. В каждую колбу отмеряют 25см³ 0,1 моль/дм³ раствора бромной смеси; колбы закрывают пробками и ставят в темное место на 1 час. Затем в колбы добавляют по 10 см³ 10%-го раствора КJ и выделившийся йод оттитровывают 0,1 моль/дм³ раствором тиосульфата натрия, прибавляя в конце титрования (при светло-желтой окраске раствора) 2 – 3см³ 1%-го раствора крахмала.

По разности между результатами титрования контрольной пробы и дистиллята определяют объем раствора тиосульфата натрия (он эквивалентен раствору бромной смеси), пошедшего на реакцию с фурфуролом. 1 см³ 0,1 моль/дм³ раствора брома соответствует 0,0024 г фурфурола или 0,0041 г пентозанов. Содержание пентозанов в воздушно-сухом ячмене при принятом разведении (в %):

,

где а – количество 0,1 моль/дм³ раствора тиосульфата натрия, пошедшего на

титрование контрольной пробы, см³;

б – то же, на титрование дистиллята, см³;

500 – общий объем дистиллята, см³;

100 – объем дистиллята, взятого для титрования, см³;

н – навеска муки, г.

Лабораторная работа № 3

Исследование изменения активности амилолитических ферментов ячменного солода при его проращивании

В основе технологических процессов бродильных производств лежат биохимические превращения веществ, катализируемые разнообразными ферментами. Так, с действием ферментов связано осахаривание крахмала, превращение белков и полипептидов в усвояемые дрожжами аминокислоты, а также растворение солода. Названные выше процессы катализируются гидролитическими ферментами. Сбраживание же сахаров сусла в спирт и получение микробного кормового белка происходит под действием оксидоредуктаз, изомераз, лиаз и лигаз, локализированных в дрожжах.

Источники гидролитических ферментов разнообразны. В небольшом количестве они содержатся в растительном сырье. При проращивании увлажненного сырья количество ферментов возрастает, появляются новые ферменты. Солод используется в производстве спирта и пива как источник гидролаз. В последние годы широкое распространение получили ферментные препараты (ФП) микробного происхождения различного спектра действия и степени очистки.

Независимо от характера действия и агрегатного состояния солода и ФП определение их активности включает три стадии: подготовку ферментных материалов к анализу, выбор и приготовление раствора специфического субстрата, проведение ферментативной реакции в заданных условиях с последующей количественной оценкой процесса.

Точность определения активности солода и ФП микробного происхождения тесно связана с обеспечением метрологических требований к отбору проб объектов исследования, составу субстрата и условиям проведения ферментативной реакции.

Ферментные препараты, обладающие амилолитической активностью, обычно содержат несколько разновидностей амилолитических ферментов.

Солод, приготовленный из различных культур зерна (ячмень, рожь, пшеница, овес, просо, чумиза), содержит различные количества ферментов: - и -амилазы, олиго-1,6-глюкозидазы.

По количеству ферментов, накапливающихся при проращивании, зерновые культуры можно разделить на три группы:

1) группа ячменя;

2) группа проса;

3) группа овса.

Первая группа: ячмень, рожь, пшеница. Зерна этой группы дают при проращивании солод с высоким содержанием - и -амилазы, но с незначительным содержанием олиго-1,6-глюкозидазы.

Солод из зерна второй группы (просо) характеризуется низким содержанием -амилазы, средним – -амилазы и высоким – олиго-1,6-глюкозидазы.

Солод из зерна третьей группы (овес) по содержанию ферментов занимает промежуточное положение между первой и второй группами.

Для возможно полного осахаривания крахмала на спиртовых заводах применяют смесь из солодов из двух или трех указанных групп зерна. Такая смесь будет содержать достаточное количество всех необходимых ферментов.

Ферментные препараты содержат -амилазу, глюкоамилазу и мальтазу.

Цель работы. Определить декстриногенную и осахаривающую активность свежепроросшего солода.

Ферментные препараты, обладающие амилолитической активностью, обычно содержат несколько разновидностей амилолитических ферментов.

Гидролиз крахмала катализируют -амилаза (декстриногенамилаза, -1,4-глюкан-4-глюканогидролаза), -амилаза (сахарогенамилаза, -1,4-глюкан-мальтогидралаза), глюкоамилаза (-1,4-глюкан-гидролаза) и конечная декстриназа (олиго-1,6-глюкозидаза). Различают суммарную амилолитическую активность, отражающую действие всех амилаз, которые содержатся в препарате, и активность вполне определенного фермента. В комплексном ФП получают не абсолютное значение этой величины, а косвенное, так как имеет место усиливающий эффект от совместного присутствия двух и более ферментов в одном препарате. Этот эффект тем меньше, чем меньше содержится в ФП сопутствующего амилолитического фермента или фермента близкого спектра действия.

Колориметрический метод определения декстриногенной активности

Декстриногенная активность отражает в основном действие на крахмал -амилазы.

За единицу декстриногенной активности (ДАК) принимают такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1г крахмала до декстринов за 60 минут при температуре 30С и рН среды 4,8–4,9 (для солодовых препаратов), 4,7 (для мицелиальных препаратов) и 6,0 (для бактериальных препаратов). Количество прогидролизованного крахмала устанавливают по йодной пробе.

Этот метод дает воспроизводимые результаты, по точности превосходит визуальный, позволяет определять декстриногенную активность ферментных препаратов различной степени очистки, полученных с применением таких продуцентов, как микромицеты и бактерии, а также солод различных зерновых культур. Он широко используется для анализа сусла и бражки на спиртовых заводах, для анализа полупродуктов ферментных заводов. Относительная ошибка метода 3–5%. При анализе солода она может возрасти до 7–8,5%, поэтому необходимо анализировать продукт в 3 – 5 повторностях и брать среднее значение.

Определение декстриногенной активности свежепроросшего солода

Солод готовят к анализу, переводя в раствор амилолитические ферменты. Для этого готовят основной (I) и рабочий (II) растворы. Для приготовления основного раствора навеску измельченного свежепроросшего солода (просяного – 10 г, ячменного, овсяного или ржаного – по 5 г) переносят в коническую колбу на 200 – 250 см³, заливают 10 см³ фосфатного буфера и 90 см³ дистиллированной воды. Смесь выдерживают 1 час при температуре 30С при периодическом перемешивании стеклянной палочкой, затем фильтруют через складчатый фильтр. Фильтрат представляет собой основной раствор I. Рабочий раствор ферментов солода II готовят из основного раствора, разбавляя его водой так, чтобы в рабочем растворе, введенном в реакцию, содержалось количество ферментов, обеспечивающих гидролиз крахмала в принятых условиях, на 20 – 70% (таблица 2).

Таблица 2 – Приготовление рабочего раствора солода

Ожидаемая активность солода, ДАК, ед/г	Масса солода в 5 см^3 рабочего раствора, мг	Расход основного раствора, см^3	Общий объем разбавленного раствора II, см^3
Просяной солод
5-10	30	6	100
10-15	30	4	100
15-20	10	2	100
15-20	20	4	50
Ячменный, овсяный, ржаной солод
15-20	20	4	50
20-30	10	2	50
30-50	7,5	3	100

Аппаратура и реактивы. Фотоэлектроколориметры ФЭК-60, КФК-2МП; фосфатный буферный раствор рН 4,7–4,9 (для приготовления раствора отвешивают 11,876 г гидроортофосфата натрия Nа₂НРО₄ и 9,079 г дигидрофосфата калия КН₂РО₄. Навески солей растворяют раздельно в дистиллированной воде в колбах на 1 дм³ и доводят содержимое до метки – получают растворы солей I и II. Для получения буферного раствора с рН 4,85 перед анализом растворы I и II смешивают в соотношении 1 : 1); 0,1 моль/дм³ раствор НСl; раствор йода для йод-крахмальной реакции (вначале готовят основной раствор йода, для чего 0,5 г кристаллического йода и 5 г йодида калия растворяют в бюксе с притертой крышкой в небольшом количестве воды. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу с пробкой на 200 см³ и доводят водой до метки. Раствор перемешивают и оставляют на хранение в темном месте. По мере необходимости из него готовят рабочий раствор путем разбавления 2 см³ исходного раствора 0,1 моль/дм³ раствора НСl в мерной колбе на 100 см³. При этом определяют оптическую плотность рабочего раствора при длине волны 453 нм в кювете с длиной рабочей грани 10 мм: она должна быть 0,220  0,01 (ФЭК-60). В необходимых случаях ее доводят до требуемой добавлением нескольких капель кислоты или основного раствора йода, который хранят не более 30 суток); 1%-й раствор крахмала (для приготовления субстрата необходимо взять такое количество воздушно-сухого растворимого картофельного крахмала, которое содержало бы 1 г сухого вещества). При известной влажности W воздушно-сухого крахмала величина его навески составит 1100:(100–W) г. Навеску крахмала переводят в мерную колбу на 100 см³, добавляют в нее 25 см³ воды и перемешивают. Затем добавляют еще 25 см³ воды и колбу помещают в кипящую водяную баню на 20 мин, непрерывно перемешивают содержимое до полного растворения крахмала. Затем колбу охлаждают и в нее добавляют 10 см³ фосфатного буферного раствора (рН 4,8 – 4,9). Раствор доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и используют для проведения анализа. Его готовят в день проведения анализа. Допускается хранение субстрата в холодильнике и употребление в течение 5 – 10 дней после его приготовления. В этом случае каждый раз субстрат кипятят 5 – 7 минут для растворения студня, а затем охлаждают и используют в опыте. Качество полученного субстрата контролируют по реакции с йодом. Для проверки Dсубстрата в пробирку наливают 10 см³ 1%-го раствора крахмала и добавляют 5 см³ дистиллированной воды, смесь хорошо перемешивают. Затем в коническую колбу наливают 50 см³ раствора рабочего йода и 0,5 см³ смеси. Полученный окрашенный раствор колориметрируют на ФЭК при =656 нм в кювете с длиной рабочей грани 10 мм по сравнению водой. D должно быть не менее 0,70.

Ход определения. В две пробирки диаметром 2 см и высотой 18 см наливают 10 см³ субстрата и помещают их в ультратермостат или водяную баню с температурой 300,2⁰С на 10 минут. Затем, не вынимая пробирок из термостата, в первую добавляют 5 см³ дистиллированной воды (контрольная проба), а во вторую – 5 см³ рабочего раствора фермента II (испытуемая проба). Смеси быстро перемешивают и выдерживают при температуре 30⁰С в течение 10 минут, отмечая время по секундомеру. Спустя 10 минут пробирки вынимают из термостата и из каждой отбирают по 0,5 см³ прогидролизованного раствора раздельно в две колбы, в которые предварительно наливают по 50 см³ рабочего раствора йода, приготовленного на разбавленной соляной кислоте. Содержимое колб перемешивают. Соляная кислота сразу прерывает действие ферментов. Полученные растворы приобретают различную окраску: контрольный имеет синий цвет, а опытный – фиолетовый цвет различной степени интенсивности в зависимости от количества прогидролизованного крахмала по отношению к дистиллированной воде. Для работы используют кюветы с длиной рабочей грани 10 мм и красный светофильтр ( = 656 нм). Значение D₁ должно быть не менее 0,690.

Количество прогидролизованного крахмала С (в г) вычисляют из соотношения

0,1 : С = D₁ : (D₁ – D₂), откуда С = 0,1  (D₁ – D₂) : D₁,

где 0,1 – количество исходного крахмала, введенного в ферментативную реакцию, г;

D₁ – оптическая плотность контрольного раствора (раствор крахмала и воды);

D₂ – оптическая плотность опытного раствора с ферментом.

Если количество прогидролизованного крахмала С окажется меньше 0,02 или больше 0,07 г, опыт повторяют с большим или меньшим количеством основного раствора фермента I. Если же 0,02  С 0,07, то ДАК свежепроросшего солода (в ед/г) вычисляют по формуле

ДАК = (6,889  С – 0,029388)  1000 : Н,

где 6,889 и 0,029388 – коэффициенты рабочего уравнения, математически описывающего прямолинейную зависимость количества прогидролизованного крахмала от количества ферментов солода, взятого для эксперимента. В коэффициенты введен множитель для пересчета на 1 ч действия фермента;

1000 – коэффициент пересчета в г;

н – количество исходного солода, участвующего в сфере ферментативной реакции, мг.

Для расчета ДАК в международных стандартных единицах принимают условно, что молекулярная масса крахмала соответствует молекулярной массе остатка глюкозы (180 – 12 = 162). В этом случае за единицу активности принимают такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль крахмала за 1 мин в условиях опыта. Пересчет одной условной единицы активности с размерностью г/ч/г на стандартные международные единицы с размерностью мкмоль/мин/г осуществлен следующим образом: 1 ед/г = 10⁶ : 162  60 = = 103 мкмоль/мин/г, где 10⁶ – перевод граммов в милиграммы; 162 – условное значение молекулярной массы крахмала; 60 – перевод времени действия фермента в минуты. Из этих расчетов видно, что условная единица равна 103 стандартным международным.

Пример. Требуется определить ДАК ячменного солода влажностью 40% среднего качества, если D₁ = 0,725, D₂ = 0,500, а расход основного раствора ферментов солода I для приготовления рабочего раствора II составил 2 см³.

Проверяем, удовлетворяет ли величина прогидролизованного крахмала условиям эксперимента: С = (0,725 – 0,500)  0,1 : 0,725 = 0,031, т.е. 0,02 С  0,07.

Количество солода Н, участвующее в реакции, равно 5  2  5  1000 : : (100  50) = 10 мг.

Декстриногенная активность исследуемого солода составляет:

ДАК = (6,889  0,031 – 0,029388)  1000 : 10 = 18,42 ед/г.

В пересчете на абсолютно сухое вещество ДАК = 30,7 ед/г.

Поляриметрический метод определения осахаривающей активности

Метод основан на определении поляризации субстрата, обработанного ферментами солода или ФП, в сравнении с контролем. За единицу осахаривающей активности ОАК принимается такое количество фермента, которое гидролизует при температуре 50⁰С в течение 30 минут при рН 4,7 – 4,9 до низкомолекулярных углеводов 1 г крахмала субстрата, составляющего 10% от введенного в реакцию.

Определение осахаривающей активности свежепроросшего солода

Вначале готовят вытяжку и фильтрат ферментов из солода, как и при определении ДАК. При работе с солодами применяют фосфатный буферный раствор. Для анализа используют рабочие растворы ферментов.

Реактивы и аппаратура. Субстрат – 2%-й раствор растворимого картофельного крахмала; 30%-й раствор сульфата цинка; 15%-й раствор гексациано-(II)-феррата калия; 1 моль/дм³ раствор соляной кислоты; фосфатный буферный раствор с рН 4,7 – 4,94; ультратермостат; сахариметр СУ‑3.

Ход определения. В две пробирки (d = 18 мм, l = 180 мм) наливают по 20 см³ субстрата; субстрат инкубируют в ультратермостате при температуре 50⁰С в течение 5 – 10 минут. Затем к содержимому одной пробирки добавляют 10 см³ рабочего раствора ферментов, перемешивают и выдерживают в термостате при температуре 500,2⁰С точно 30 минут. Затем быстро инактивируют ферменты добавлением 1 см³ 1 моль/дм³ соляной кислоты и осаждают оптически активные несахара двойным осадителем. Для этого приливают в пробирку 1 см³ сульфата цинка и после перемешивания – 1 см³ раствора гексациано-(II)-феррата калия; содержимое пробирки охлаждают до температуры 20⁰С.

Одновременно в другой пробирке готовят контрольный раствор по схеме: 10 см³ раствора фермента, 1 см³ раствора 1 моль/дм³ соляной кислоты, по 1 см³ осадителей и 20 см³ субстрата. Работа ведется при температуре 20⁰С.

Содержимое пробирок перемешивают и фильтруют через складчатый фильтр. Испытуемый и контрольный фильтраты поляризуют в трубке длиной 200 мм. Определив поляризацию контрольного (П_к) и испытуемого (П_о) растворов, вычисляют разность угла вращения П плоскости поляризации этих растворов: П = П_к  П_о. Значение П на поляриметре СУ-3 должно быть не менее 0,2⁰.

При анализе солодов для расчетов ОАк_п применяют уравнение

ОАК_п = (0,050П + 0,0114)  10³ : Н,

где 0,050 и 0,0114 – коэффициенты, найденные опытным путем;

Н – количество солода в реакционной среде, мг.

Пример. Определить ОАк_п ячменного солода влажностью 42%, если на приготовление 100 см³ основного раствора ферментов израсходовали 5 г солода.

Основной раствор разбавлен в 20 раз (5 см³ : 100 см³). Следовательно, в реакцию введено Н = 5  5  10  1000 : (100  100) = 25 мг солода.

При поляризации фильтратов субстрата на поляриметре СУ – 3 получено П_к = 14,1⁰, П₀ = 12,6⁰ и П = 14,1 – 12,6 = 1,5⁰.

Тогда осахаривающая активность влажного солода

ОАк_п = (0,050 1,5 + 0,0114)  10³ : 25 = 3,45 ед/г, или в пересчете на абсолютно сухое вещество ОАк_п = 3,45  100 : (100 – 42) = 5,95 ед/г.

Ячменный солод с ОАк_п = 3,45 ед/г относится к солодам среднего качества.

Поляриметрический метод, предусматривающий гидролиз при высокой температуре (50⁰С), позволяет достаточно точно установить за 30 мин изменение состава субстрата по его поляризации.

Благодаря небольшой длительности метода, малому числу операций, использованию оптического прибора он получил широкое распространение в спиртовой промышленности. Точность метода несколько ниже, чем йодометрического, и составляет 5 – 7%.

Таблица 3 – Изменение активности амилолитических ферментов ячменного солода при прорастании

Сутки прорастания ячменного солода	Активность амилолитических ферментов солода, ед/г
	декстриногенная	осахаривающая
Вторые
Третьи
Пятые
Седьмые

Лабораторная работа № 4

Определение ферментативной активности ферментных препаратов

Определение осахаривающей активности йодометрическим методом

Осахаривающая активность характеризует способность солода или ФП микробного происхождения гидролизовать крахмал до редуцирующих сахаров: мальтозы, глюкозы или их смеси. Мальтоза является конечным продуктом гидролиза крахмала растительными - и -амилазами. Таким образом, осахаривающая активность отражает действие одного или нескольких ферментов на данный субстрат. Осахаривающую активность ОАК (в литературе чаще принято называть ее ОС) выражают числом единиц, содержащихся в 1 г, 1 см³ осахаривающего материала.

Осахаривающую активность определяют тремя методами: йодометрическим, колориметрическим с использованием антрона и поляриметрическим.

Осахаривающая активность определяется в условиях гидролиза растворимого крахмала в пределах 25% гликозидных связей, что соответствует гидролизу примерно 50% крахмала до мальтозы или мальтозы в смеси с глюкозой. За единицу ОАК принимают такое количество фермента, которое в строго определенных условиях за 1 мин при температуре 30⁰С катализирует расщепление до восстанавливающих сахаров 1 микроэквивалент гликозидных связей.

Определение осахаривающей активности амилосубтилина Г10х

Анализу подвергают препарат, полученный при выращивании продуцента глубинным способом.

Реактивы и аппаратура: 0,1 моль/дм³ раствор йода (25 г КJ ч.д.а. растворяют в 2 – 3 см³ воды и добавляют 12,5 г х.ч. йода. После растворения йода объем раствора доводят до 1 дм³ дистиллированной водой. Раствор хранят в темной склянке с притертой пробкой. Титр устанавливают по 0,1моль/дм³ раствору тиосульфата натрия. Концентрация раствора йода должна быть в пределах 0,95 – 1,05 моль/дм³); 0,1 моль/дм³ раствор тиосульфата натрия (25 г тиосульфата ч.д.а. растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды, не содержащей СО₂); 1 моль/дм³ раствор НС1; 0,1моль/дм³ раствор гидроксида натрия; раствор серной кислоты 1 : 4 (к четырем объемам дистиллированной воды приливают один объем кислоты); фосфатный буферный раствор с рН 6,0 готовят смешиванием 9 объемов раствора I (9,077 г КН₂РО₄ растворяют в 1 дм³ воды) и одного раствора 2 (23,883 г К₂НРО₄  2Н₂О растворяют в 1 дм³ воды); 1%-й раствор крахмала.

Ход определения. Вначале готовят 1%-й раствор крахмала, как при определении амилолитической активности солода, но вместо фосфатного буфера с рН 4,7 – 4,9 используют 10 см³ фосфатного буферного раствора с рН6,0.

Для приготовления раствора ФП взвешивают 0,1 г препарата в сухом стакане вместимостью 25–30 см³. Навеску осторожно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством воды. Полученную смесь быстро и без потерь переносят дистиллированной водой в колбу на 100 см³. После доведения до метки смесь перемешивают и фильтруют через складчатый фильтр. Раствор хранят не более 24 ч при температуре от +2 до –4⁰С. Далее осахаривают крахмал и определяют сахар йодометрически. Схема рабочего и контрольного опытов, которые проводят одновременно, приведена ниже.

Расхождение между результатами титрования контрольного Б и опытного А растворов должно составлять 0,5 – 6 см³ 0,1 моль/дм³ раствора тиосульфата натрия. Если расхождение меньше 0,5 или больше 6 см³, анализ повторяют с большим или меньшим количеством ферментного раствора.

Осахаривающую активность ОАК (в ед/г) рассчитывают по формуле

ОАК = е₁ : (m τ),

где е₁ – количество единиц активности в микроэквивалентах гликозидных связей, найденных по табл. 4, в соответствии с результатами титрования;

m – количество ФП, введенного в реакционную смесь, г;

τ – время гидролиза, мин.

Пример. Определить осахаривающую активность амилосубтилина Г10х, если на анализ израсходовано 0,1 г исходного ФП.

На титрование контрольного раствора пошло 19,6 см³ (Б), а рабочего – 17,6 см³ (А) 0,1 моль/дм³ раствора Na₂S₂O₃ , следовательно, Б – А = 19,6 – 17,6 = 2 см³. По таблице 4 величине 2 см³ соответствует число единиц активности е₁ = 113,1. Время гидролиза – 10 мин; m = (0,1 : 100)  1 = 0,001 г. Тогда ОАК = 113,1 : (0,001  10) = = 11310 ед/г.

	Рабочий опыт (А)		Контрольный опыт (Б)
	1%-й раствор крахмала (20 см^3)		1%-й раствор крахмала (20 см^3)
	Инкубирование субстрата в конической колбе на 50 см^3 ( t = 30  0,2^0С, τ = 10 мин)	1 моль/дм^3 р-р НС1 2 см^3	Смешивание субстрата с соляной кислотой
	20 см^3		22 см^3
Р-р ФП 1-10 см^3 Вода 9-0 см^3	Ферментативный гидролиз крахмала до сахаров ( t = 30  0,2^0С, τ = 10 мин)	Р-р ФП 1-10 см^3 Вода 9-0 см^3	Смешивание подкисленного субстрата с р-ром ферментов (инактивация ферментов)
	30 см^3		32 см^3
1 моль/дм^3 р-р НС1 2 см^3	Кислотная инактивация ферментов
	32 см^3
0,1 моль/дм^3 р-р J2 20 см^3 0,1 моль/дм^3 р-р NаОН 52,5 см^3	Йодометрическое окисление сахаров прогидролизованного субстрата в щелочной среде (t = 20 ^0С, τ = 15 мин; колба коническая на 300-400 см^3, закрытая часовым стеклом)	0,1 моль/дм^3 р-р J2 20 см^3 0,1 моль/дм^3 р-р NаОН 52,5 см^3	Йодометрическое окисление сахаров исходного субстрата и ФП (t = 20 ^0С, τ = 15 мин; колба коническая на 300-400 см^3, закрытая часовым стеклом)
	104,5 см^3		104,5 см^3
Р-р Н2SО4 : Н2О = 1 : 4 2 см^3	Нейтрализация и подкисление среды	Р-р Н2SО4:Н2О=1:4 2 см^3	Нейтрализация и подкисление среды
	106,5 см^3		106,5 см^3
0,1 моль/дм^3р-р Na2S2O3	Определение избытка йода в рабочем опыте	0,1 моль/дм^3р-р Na2S2O3	Определение избытка йода в рабочем опыте

Расчет величины А Расчет величины Б

Рисунок 1 – Схема определения осахаривающей активности ферментного препарата

Таблица 4 – Количество микроэквивалентов гликозидных связей (е₁) в зависимости от расхода 0,1 моль/дм³ раствора Na₂S₂O₃

Количество 0,1 моль/дм^3 раствора Na2S2O3, см^3	Количество микроэквивалентов гликозидных связей, е1	Количество 0,1 моль/дм^3 раствора Na2S2O3, см^3	Количество микроэквивалентов гликозидных связей, е1
0,9	45,0	2,6	169,7
1,0	52,1	2,7	180,9
1,1	58,7	2,8	192,3
1,2	63,3	2,9	209,9
1,3	67,8	3,0	226,1
1,4	74,7	3,1	250,6
1,4	81,4	3,2	278,2
1,6	85,9	3,3	312,1
1,7	92,7	3,4	366,2
1,8	99,6	3,5	452,3
1,9	108,5	3,6	517,9
2,0	113,1	3,7	585,7
2,1	119,9	3,8	662,7
2,2	128,8	3,9	740,3
2,3	138,0	4,0	811,9
2,4	150,3	4,1	891,6
2,5	158,3	4,2	968,1

Определение протеолитической способности методом Лейлян‑Фольгарда

Протеолитическая способность (ПС) характеризует способность протеолитических ферментов расщеплять белок (казеин). За единицу протеолитической способности принято такое количество фермента, которое за 1 час при температуре 30⁰С расщепляет 1 г казеина. Протеолитическую способность выражают числом указанных единиц в 1 г сухого препарата. При таком способе выражения ПС непосредственно показывает, сколько граммов казеина может быть прогидролизовано 1 г культуры при температуре 30⁰С за 1 ч (в условиях, соответствующих условиям определения).

Для определения ПС растворенный при помощи гидроксида натрия казеин подвергают действию исследуемого ферментного препарата. После ферментативного воздействия в течение часа в опыте и перед добавлением такого же количества ферментного раствора в контроле ферментативную активность прерывают титрованным раствором соляной кислоты. Казеин, оставшийся нерасщепленным, количественно осаждают сульфатом натрия. Выпадая в осадок, казеин увлекает в связанном состоянии соответствующее количество соляной кислоты. Осадки отфильтровывют, а фильтраты титруют 0,1 моль/дм³ раствором NаОН. Разность между расходом 0,1 моль/дм³ раствора NаОН на титрование в опыте и в контроле принимают за меру протеолитической активности исследуемой культуры.

Реактивы: 5%-й щелочной раствор казеина – 50 г (по сухому веществу) технически измельченного казеина помещают в химический стакан емкостью 1 дм³, добавляют 50 см³ дистиллированной воды и оставляют на 30 мин. Затем помещают стакан в водяную баню температурой 65–70⁰С. Постепенно при тщательном перемешивании стеклянной палочкой прибавляют 50 см³ 1 моль/дм³ раствора NаОН. В процессе растворения казеина прибавляют небольшими порциями воду (5–6 раз по 50–80 см³), нагретую до температуры 65–70⁰С, и выдерживают на водяной бане до полного исчезновения комочков. После полного растворения казеина и охлаждения раствор переливают в мерную колбу на 1 дм³, доводят объем до метки водой, перемешивают и фильтруют через четыре слоя марли; 0,1 моль/дм³ раствор НС1 в 7,5%-ом растворе сульфата натрия - Na₂SO₄; 1 моль/дм³ раствор NаОН; 0,1 моль/дм³ раствор NаОН; раствор крезолового красного – 0,5 г крезолового красного растворяют в 100 см³ 96%-го ректификованного спирта и фильтруют.

Ход определения. Ферментный раствор приготавливают так: на технических весах взвешивают 1,00 г тщательно измельченной культуры, переводят в колбу на 200–300 см³, приливают 50 или 100 см³ дистиллированной воды и настаивают в течение часа при комнатной температуре, периодически перемешивая через каждые 10 мин, затем фильтруют через складчатый фильтр.

В колбы емкостью около 100 см³ (два параллельных определения) набирают пипеткой по 20 см³ раствора казеина и помещают в водяную баню температурой 300,2⁰С. Через 10 мин в колбы вводят при помешивании 10 см³ ферментного раствора. Общий объем раствора казеина и ферментного раствора должен быть равен 30 см³; если для определения берут меньше 10 см³ ферментного раствора, недостающий до 30 см³ объем восполняют дистиллированной водой, которую вводят непосредственно перед введением ферментного раствора.

Ровно через час в колбы добавляют при перемешивании 20 см³ 0,1 моль/дм³ раствор НС1 в 7,5%-ом растворе Na₂SO₄ и немедленно фильтруют до полной прозрачности, возвращая фильтрат на фильтр.

Контрольные пробы (также два параллельных определения) ставят таким же образом, только до введения ферментного раствора прибавляют раствор НС1 в 7,5%-ом растворе Na₂SO₄ и не выдерживают колбы на водяной бане, а сразу фильтруют.

В 20 см³ фильтрата контрольных и опытных определений оттитровывают избыток соляной кислоты 0,1 моль/дм³ раствором NaOH в присутствии двух капель крезолового красного до красного окрашивания. Разность в расходе на титрование опытных и контрольных проб 0,1 моль/дм³ раствора NaOH, отнесенная к 10 см³ фильтрата, может составить 0,4–2,5 см³. Если она менее 0,4 или более 2,5 см³, определение повторяют с большей или меньшей дозировкой фермента, изменяя количество вводимого ферментного раствора или его разведение. По разности расхода щелочи на титрование опытной и контрольной проб, пользуясь таблицей 5, находят протеолитическую способность культуры при условии, что для определения взято 10 см³ ферментного раствора в разведении 1 : 100. При других дозировках культуры величину ПС рассчитывают по формуле

ПС = е / n,

где е – число единиц, найденное по таблице (по результатам титрования);

n – количество культуры, соответствующее 10 см³ фильтрата (1/5 от количества,

прибавленного в колбу), г или см³.

Пересчет активности на сухое вещество ведут по формуле

,

где W – влажность культуры, %.

Пример. Для определения взято 10 см³ ферментного раствора в разведении 1 : 100. На титрование опытной пробы израсходовано 4,8 см³ 0,1моль/дм³ раствора NaOH; на титрование контрольной пробы – 2,0 см³. Разность в пересчете на 10 см³ фильтрата (4,8 – 2,0) : 2 = 1,4 см³ 0,1 моль/дм³ раствора NaOH. По таблице величина 1,4 соответствует ПС = 4,950.

Влажность культуры 12%.

ед.

Таблица 5 – Пересчет (см³) 0,1 моль/дм³ раствора NaOH в протеолитическую способность на воздушно-сухое вещество

Разность между расх. 0,1 моль/дм^3 р-ра NaOH в опыте и контроле, см^3 / 10 см^3 фильтрата	Едини-цы протео-лити-ческой актив-ности	ПС при введении 10 см^3 раствора в разведении		Разность между расх. 0,1 моль/дм^3 р-ра NaOH в опыте и контроле, см^3 / 10 см^3 фильтрата	Едини-цы протео-лити-ческой актив-ности	ПС при введении 10 см^3 раствора в разведении
		1 : 100	1:50			1:100	1:50
0,30	0,0123	0,615	0,308	1,45	0,1033	5,165	2,582
0,35	0,0167	0,835	0,418	1,50	0,1080	5,400	2,700
0,40	0,0203	1,015	0,508	1,55	0,1123	5,616	2,808
0,45	0,0243	1,215	0,608	1,60	0,1167	5,835	2,918
0,50	0,0283	1,415	0,708	1,65	0,1213	6,065	3,032
0,55	0,0320	1,600	0,800	1,70	0,1260	6,300	3,150
0,60	0,0360	1,800	0,900	1,75	0,1307	6,535	3,268
0,65	0,0393	1,965	0,982	1,80	0,1353	6,765	3,382
0,70	0,0433	2,165	1,082	1,85	0,1400	7,000	3,500
0,75	0,0473	2,365	1,182	1,90	0,1453	7,265	3,632
0,80	0,0513	2,565	1,282	1,95	0,1500	7,500	3,750
0,85	0, 0550	2,750	1,375	2,00	0,1556	7,780	3,890
0,90	0,0590	2,950	1,475	2,05	0,1603	8,015	4,008
0,95	0,0627	3,135	1,568	2,10	0,1653	8,265	4,132
1,00	0,0667	3,335	1,668	2,15	0,1707	8,535	4,268
1,05	0,0700	3,500	1,750	2,20	0,1760	8,800	4,400
1,10	0,0747	3,735	1,868	2,25	0,1817	9,085	4,542
1,15	0,0787	3,935	1,968	2,30	0,1873	9,365	4,682
1,20	0,0827	4,135	2,068	2,35	0,1933	9,665	4,832
1,25	0,0867	4,335	2,168	2,40	0,1993	9,965	4,982
1,30	0,0907	4,535	2,268	2,45	0,2053	10,265	5,182
1,35	0,0950	4,750	2,375	2,50	0,2113	10,565	5,282
1,40	0,0990	4,950	2,475