Методика спектрофотометрического измерения активности каталазы

Принцип методаоснован на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс(Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело., 1988, № 1, с. 16-19).

Реактивы: раствор молибдата аммония ((NH₄)₆Mo₇O₂₄4H₂O) 4%, раствор перекиси водорода (H₂O₂) 0.03%.

Приборы и посуда: пробирки стеклянные (10 мл), пипетки измерительные (0.1 мл, 1 мл, 2 мл, 5 мл), пробирки центрифужные, кюветы спектрофотометрические с толщиной слоя 10 мм, ультратермостат UTU-2/77, электросушилка SPW 65M, центрифуга MPW-310, спектрофотометр СФ-46.

Ход определения. Реакция запускается добавлением 0.1 мл сыворотки крови или гомогената тканей к 2 мл раствора перекиси водорода 0.03%. В холостую пробу вместо гомогената вносят 0.1 мл дистиллированной воды. Содержимое обеих пробирок инкубируют 10 мин при температуре 37°С. Реакцию останавливают добавлением 1 мл молибдата аммония 4%. Содержимое пробирок центрифугируют 10 минут при 6 тыс. об/мин. Интенсивность развившейся окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм (лампа накаливания) против контрольной пробы, в которую вместо перекиси водорода вносят 2 мл дистиллированной воды.

Активность каталазы рассчитывают по формуле:

для гомогената ткани E = (A_хол-А_оп)·V·t·K/m

для сыворотки крови E = (A_хол-А_оп)·V·t·K,

где E – активность каталазы (мкат/мг),

A_холи А_оп – экстинция холостой и опытной проб,

V – объем вносимой пробы (0,0001л),

t – время инкубации (600с),

m – масса ткани во вносимой пробе (мг).

K – коэффициент миллимолярной экстинции перекиси водорода

(22.2·10³мМ^-1·см^-1).

1 катал (кат) – это такая каталитическая активность, которая увеличивает скорость реакции на 1 моль/сек в определенной тест-системе [30].

Пересчёт:

1 мкмоль/мин = 1 ед. акт. = 16.67 нкат.

1 ммоль/мин = 0.01667 мкат.

Результаты исследования и их обсуждение

Табл. 1. Показатели СРО/АОС у групп старыхживотных, среднеестандартное отклонение.

группа 1 – контроль

группа 2 – введение даларгина по схеме

группа 3 – стресс-контроль

группа 4 – стресс и введение даларгина по схеме

Группа	Кровь	Печень		Головной мозг
	Каталаза, Мкат/л	Каталаза, ммоль/мин на г ткани	МДА, нмоль на г ткани	Каталаза, ммоль/мин на г ткани	МДА, нмоль на г ткани
1	62,57,54 *	78,0461,89	746180 *, (**)	10726,94 (*)	732105 *,**
2	81,53,6 **	99,310,69 **	47780 (**)	134,3917,66 **	471143 **
3	63,2212,3 *	86,441,05 *	528145 (*)	130,262,7	1140326
4	115,8811,8	209,584,14	368102	188,4124,36	762190

Примечание:

* p<0,05 у группы 1 по отношению к 2 и у группы 3 по отношению к 4

(*) p<0,1 у группы 1 по отношению к 2 и у группы 3 по отношению к 4

** p<0,05 у группы 1 по отношению к 3 и у группы 2 по отношению к 4

(**) p<0,1 у группы 1 по отношению к 3 и у группы 2 по отношению к 4

Табл. 2. Показатели СРО/АОС у групп зрелыхживотных, среднеестандартное отклонение.

группа 1 – контроль

группа 2 – введение даларгина по схеме

группа 3 – стресс-контроль

группа 4 – стресс и введение даларгина по схеме

Группа	Кровь	Печень		Головной мозг
	Каталаза, Мкат/л	Каталаза, ммоль/мин на г ткани	МДА, нмоль на г ткани	Каталаза, ммоль/мин на г ткани	МДА, нмоль на г ткани
1	45,784,85	64,2121,9 **	40989 *	88,5345,23	687141
2	5511 **	76,3337,8 **	20042 **	103,0622,7 **	598102
3	69,5826,53 (*)	1234,9 *	47893 *	125,577,07	756326
4	11149,5	16019,7	39046	13019,2	590127

Примечание:

* p<0,05 у группы 1 по отношению к 2 и у группы 3 по отношению к 4

(*) p<0,1 у группы 1 по отношению к 2 и у группы 3 по отношению к 4

** p<0,05 у группы 1 по отношению к 3 и у группы 2 по отношению к 4

(**) p<0,1 у группы 1 по отношению к 3 и у группы 2 по отношению к 4

Табл. 3. Изменение содержания МДА и каталазы в различных тканях при изучаемых воздействиях в зависимости от возраста.

Группы животных	Кровь	Печень		Головной мозг
	Каталаза, %	Каталаза, %	МДА, %	Каталаза, %	МДА, %
старые животные, введение даларгина *	130,4	127,24	64	125,6	64,4
зрелые животные, введение даларгина *	120,1	118,8	48,9	116,4	87,1
старые животные, стресс-контроль *	101,1	110,7	71	121,7	155,7
зрелые животные, стресс-контроль *	152	191,5	116,8	141,7	110
старые животные, стресс и введение даларгина *	185,4	268,4	49,4	176	104,1
зрелые животные, стресс и введение даларгина *	242,5	249,2	95,4	146,8	85,9
старые животные, стресс и введение даларгина **	142,2	211	87,2	140,2	161,8
зрелые животные, стресс и введение даларгина **	201,8	209	195	126,1	98,7

Примечение: * - по отношению к контролю соответствующего возраста

** - по отношению к введению даларгина без стресса

Рис. 5. Возрастные особенности содержания каталазы (слева) и МДА (справа) при введении даларгина, % от контроля.

Рис. 6. Возрастные особенности изменения содержания каталазы (слева) и МДА (справа) при стрессе, % от контроля.

Рис. 7. Возрастные особенности изменения содержания каталазы (слева) и МДА (справа) при стрессе на фоне введения даларгина, % от контроля.

Рис. 8. Возрастные особенности изменения содержания каталазы (слева) и МДА (справа) при стрессе на фоне введения даларгина, % от группы, получавшей даларгин.

В результате эксперимента были подтверждены имеющиеся сведения о воздействии даларгина на перекисное окисление, а также показаны возрастные различия этого воздействия.

При сравнении контрольных групп животных было показано, что содержание антиокислительного фермента каталазы в исследуемых тканях было повышенным в группе животных старого возраста (для содержания каталазы в крови различия достоверны, p<0,05). Вместе с тем, параллельно выявлено и возрастное повышение содержания МДА в печени и головном мозге в группе старых животных по сравнению со зрелыми (для печеночной ткани различия достоверны,p<0,05). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в организме с возрастом нарастает интенсивность процессов перекисного окисления и соответственное компенсаторное повышение уровня антиоксидантов, которое, однако, не компенсирует в полной мере прогрессирование процессов ПОЛ – данные согласуются как с полученными нами ранее результатами, так и с данными литературы. Представленные возрастные особенности создают предпосылки для различий в действии экзогенных антиоксидантов.

При введении даларгина по указанной ранее схеме получены следующие результаты. В обоих исследованных группах показано снижение содержания МДА и увеличение концентрации каталазы для всех исследованных тканей. Как видно из рис. 5 и табл. 1 и 2, повышение содержания каталазы в тканях для группы животных старого возраста было более выраженным, и для этой группы показаны более достоверные отличия показателей от контроля (табл.3). В отношении концентрации МДА при введении даларгина нами выявлены возрастные различия, специфичные для разных органов. Так, в печени более существенно снизился уровень МДА в группе зрелых животных (зрелые – 48,9%, старые – 64% от контроля, различия недостоверны) , а в головном мозге – в группе старых животных (зрелые – 87,1%, старые – 64,4% от контроля, различия достоверны).

При стрессе мы наблюдали картину, прямо противоположную эффекту введения даларгина (рис. 7). Повышение содержания каталазы было выше у животных зрелого возраста. На фоне стресса наблюдалось снижение содержания МДА в печени и группы старых животных, причем статистически достоверное (p<0,05)– полученный результат может объясняться общим угнетением функций печени при стрессе у данной группы, однако в литературе подобных данных не встречается. В головном мозге повышение активности окислительных процессов достоверно ниже у группы зрелых животных (зрелые – 110%, старые – 155,7% от контроля).

Рассмотрим, как изменяется характер реакции на стресс по группам на фоне введения даларгина (рис 8). Во-первых, повышение содержания каталазы в печени и головном мозге у группы старого возраста превысило соответствующие показатели группы зрелого возраста. Во-вторых, хотя содержание каталазы в крови существеннее возросло в группе зрелого возраста, увеличение содержания каталазы крови у животных старого возраста по сравнению со стрессом без введения даларгина было гораздо значильнее (101% при стрессе и 185% при стрессе на фоне даларгина, по отношению к контролю). Динамика содержания МДА в печени и головном мозге выявила снижение показателей ПОЛ по отношению к контролю (в головном мозге у группы старых животных – недостоверное повышение – 104% от контроля). При этом возрастные особенности показателей по сравнению со стрессом без введения даларгина существенно не изменились.

Проведено сравнение возрастных особенностей реакции активации ПОЛ/АС при стрессе на фоне вверение даларгина по отношению к реакции на введение даларгина без стресса (рис. 9). В крови получено более значительное повышение содержания каталазы для группы зрелого возраста. В печени и головном мозге активация антиокислительного фермента существеннее в группе старых животных. Показано, что в печени при стрессе на фоне введения даларгина интенсивность ПОЛ по отношению к введению даларгина в обычных условиях повышается у зрелых животных, а в головном мозге – у старых.

При анализе результатов эксперимента было показано, что даларгин более существенно активирует антиокислительный фермент каталазу как в норме, так и в условиях стресса в группе старых животных. Исключение составляет каталаза крови, более существенно повышавшаяся при стрессе у животных зрелого возраста. Однако при этом следует учитывать, что исходно уровень этого фермента в крови зрелых животных был достоверно ниже, чем у старых (зрелые – 45,784,85, старые – 62,57,54), а при стрессе на фоне даларгина этот показатель достигал примерно одинаковой величины у зрелых и старых животных (зрелые - 11149,5, старые – 115,8811,8). Мы склонны объяснять меньшую активацию каталазы крови у старых животных тем, что с возрастом в крови повышается содержание перекисей, и фермент уже содержится у старых животных в больших концентрациях, поэтому активация за счет поверхностных резервов в ранние сроки после стресса ограничена.

Полученная динамика содержания МДА в органах при указанном воздействии показала, что чувствительность печени к даларгину варьирует в норме и при стрессе, причем в последнем случае у старых животных печеночная ткань более чувствительна в отношении ингибирования ПОЛ, чем у зрелых. Возрастные особенности содержания МДА в головном мозге показали, что чувствительность его тканей к даларгину выше у группы старых животных в обычных условиях. При стрессе введение даларгина выраженнее изменяет содержание МДА в головном мозге у зрелых животных, а у старых животных оно остается повышенным, хотя при введении даларгина это повышение гораздо меньше (155,7% от контроля при стрессе; 104% от контроля при стрессе на фоне даларгина).

Выводы

1. Введение даларгина животным активирует антиоксидантную систему, причем для группы старых животных эта активация выраженнее.

2. При стрессе инъекции даларгина до воздействия существенно изменяют возрастной характер реакции на стресс, причем повышение содержания каталазы в группе старых животных выражена значительнее, чем в группе зрелых.

3. Повышение содержания каталазы при стрессе на фоне даларгина по сравнению с введением препарата в обычных условиях выраженнее в группе старых животных.

4. Активирующее действие даларгина на антиоксидантную систему с возрастом повышается.

5. Показатели перекисного окисления в печени у старых животных изменяются при стрессе на фоне введения даларгина значительнее у старых животных.

6. Показатели перекисного окисления в головном у старых животных изменяются на фоне введения даларгина без стрессорного воздействия, значительнее у старых животных, а на при стрессе влияние даларгина на показатели перекисного окисления в головном мозге более выражено у животных зрелого возраста.