5. Хроматографія

На початку ХХ століття російський вчений М.С. Цвет відкрив спосіб адсорбційного хроматографічного аналізу речовин і поклав початок одному з ефективних методів розділення і очищення речовин – хроматографії.

Цей метод заснований на тому, що при пропусканні досліджуваного розчину або газоподібних продуктів через який-небудь адсорбент, речовини поглинаються ним з різною силою. Залежно від взаємодії між адсорбентом і речовиною, що знаходиться в розчині розрізняють три види хроматографії: адсорбційну, розподільну і іонообмінну. Як правило доводиться мати справу зі змішаними процесами при переважанні одного з них. Так, при адсорбційній хроматографії мають значення процеси іонного обміну, а при розподільній хроматографії – процеси адсорбції й іонного обміну.

Хроматографія в даний час широко застосовується перш за все для розділення малих кількостей речовин, близьких за своїм складом і властивостями; для очищення сполук, які володіють високою температурою кипіння або ж термічно нестійкі, а також для розділення деяких природних речовин, наприклад природних фарбників, амінокислот і т.п.

Адсорбційна хроматографія. Принцип адсорбційної хроматографії полягає в тому, що при пропусканні досліджуваного розчину або газоподібних продуктів через високу і порівняно вузьку колонку, наповнену подрібненим або порошкоподібним адсорбентом, речовини поглинаються відповідно до їх схильності до адсорбції в певній послідовності.

Утворюється так звана «хроматограма», яку «проявляють», пропускаючи через колонку деяку кількість чистого розчинника, як правило того ж, в якому була розчинена досліджувана речовина.

Розчинники які найбільш часто використовуються для прояву адсорбційних хроматограм можна розташувати в такому порядку: петролейний ефір, бензин, сірковуглець, чотирихлористий вуглець, бензол, хлороформ, ефір, етилацетат, ацетон, пропіловий спирт, етиловий спирт, метиловий спирт, вода, піридин. При промиванні колонки розчинником відбувається розподіл розчинених речовин по колонці, при цьому утворюються смуги або зони, що переміщаються вниз по шляху руху проявляючої рідини зі швидкістю, яка залежить від здатності даної речовини адсорбуватися адсорбентом, що знаходиться в колонці. Як правило ця властивість у різних речовин різна, тому зони більш менш чітко відділяються одна від одної.

При розділенні забарвлених речовин можна спостерігати виникнення забарвлених зон безпосередньо на безбарвних або слабо забарвлених адсорбентах. Якщо ж візуально важко визначити положення зон на стовпчику адсорбенту, то застосовують ультрафіолетове опромінювання, оскільки багато речовин флуоресціюють в ультрафіолетовому світлі. Отже, рекомендується мати колонки з кварцового скла, проникного для проміння.

Якщо ж мають справу з безбарвними і нефлуоресціюючими речовинами, то застосовують флуоресціюючі адсорбенти. Для цього до звичайного адсорбенту додають яку-небудь речовину, яка флуоресціює в ультрафіолетовому світлі, наприклад сірчистий цинк, який-небудь флуоресціюючий органічний фарбник.

Для виділення речовин з проявленої хроматограми застосовують різні прийоми. В тих випадках, коли працюють із забарвленими речовинами або коли можна легко розрізнити межі окремих зон по флуоресценції в ультрафіолетовому світлі, обережно виштовхують адсорбент з поглиненими речовинами з колонки і, розрізаючи його на зони, екстрагуються речовини з кожної зони окремо.

Інший спосіб обробки хроматограм полягає в тому, що адсорбовані речовини елюють, тобто вимивають розчинниками з колонки і збирають у вигляді окремих фракцій розчинів (елюатів). Потім у цих фракціях знаходять або кількісно визначають розділені речовини відповідними хімічними або фізичними методами. При знятті такої «рідкої хроматограми речовини», речовини, які більш сильно адсорбуються, з'являються в елюаті пізніше, ніж ті, які менш сильно адсорбуються.

При так званому витискувальному прояві для елюювання застосовують розчинник, який витісняє з колонки підлягаючі розділенню речовини в порядку зменшення міцності їх зв'язків з адсорбентом. Окрім цих описаних методів виділення речовин з хроматограм, існують найрізноманітніші способи, частково використовують кожний з цих прийомів.

У лабораторних умовах для хроматографування, як правило, користуються простим приладом, зображеним на рис. 55. Як хроматографічну колонку використовують скляну трубку, звужену в нижній частині. Іноді для підтримки заданої температури при елююванні застосовують колонку, облаштовану по типу холодильника Лібіха. Розміри трубки встановлюють залежно від умов досліду і від вимог, що пред'являються. В усякому разі, трубка не повинна бути дуже широкою, оскільки при цьому зменшується чіткість розділення зон при прояві хроматограми. В нижню частину трубки вставляють нещільний тампон, як правило, зі звичайної або скляної вати для утримання адсорбенту, а у верхню частину трубки за допомогою гумової пробки кріплять краплинну воронку.

Найпоширенішими адсорбентами є оксид алюмінію, що використовується для розділення нейтральних і основних речовин, і активоване вугілля, використовується для адсорбції речовин з водних або спиртових розчинів. Рідше застосовуються силікагель, оксид магнію, гідроксид кальцію, карбонати і сульфати лужноземельних і лужних металів, а також глюкоза, лактоза й ін.

Рис. 55. Прилад для адсорбційної хроматографії: 1 – адсорбент; 2 – пробка з вати; 3 – розчинник.

Для успішного розділення суміші велике значення має наповнення хроматографічної колонки достатньо однорідним адсорбентом, при цьому чим менше розмір частинок, тим краще відбувається розмежування зон при прояві хроматограми, але одночасно з цим збільшується і опір колонки. Щоб уникнути цього недоліку, іноді рекомендується домішувати до подрібненого адсорбенту деякі сорти інфузорного ґрунту, адсорбційна здатність якого дуже незначна. На результати хроматографії негативно впливає наявність пухирців повітря і тріщин в адсорбенті, а також нерівномірність засипки останнього. Наповнення колонки може проводитися двома способами: сухим і вологим.

Сухий спосіб наповнення. Колонку промивають гарячою хромовою сумішшю, потім дистильованою водою і висушують. Ретельно просіяний подрібнений адсорбент вносять у колонку в сухому вигляді рівномірними маленькими порціями і утрамбовують товкачем. Заповнення колонки ведуть так, щоб ¹/₃ трубки не була заповнена.

Після закінчення наповнення колонки адсорбент зволожують розчинником, знову пресують товкачем, потім вирівнюють його поверхню і поміщають зверху адсорбенту шматочок вати, який оберігає верхній шар стовпчика адсорбенту від розмиву розчинником. Поверх вати наливають шар розчинника в 5 – 7 см висотою, в протилежному випадку утворюються тріщини в адсорбенті.

Вологий спосіб наповнення. Цей метод полягає у введенні в колонку суспензії адсорбенту у відповідно підібраному розчиннику. Адсорбент і розчинник добре перемішують механічною мішалкою і через ділильну воронку при постійному помішуванні вносять суспензію в колонку. Потім на відстані 1 см від поверхні адсорбенту поміщають рихлий шматок вати, поверх якого наливають шар розчинника в 5 – 7 см висотою.

У підготовлену колонку обережно з краплинної воронки вводять розчин, що складається з суміші речовин у відповідному розчиннику. Співвідношення кількості даної суміші до адсорбенту повинно складати приблизно 1 : 100. Як тільки розчин вбереться, вливають у воронку чистий розчинник і починають прояв хроматограми. В сучасних лабораторіях елюат збирають у вигляді великого числа маленьких порцій по 0,5 – 10 мл. Цей процес здійснюється автоматично за допомогою спеціальних колекторів. Потім розчинник з елюата видаляють перегонкою або випаровуванням, виділяючи чисту речовину. Якщо виділений таким шляхом компонент суміші є рідиною, то її переганяють і визначають температуру кипіння, показник променезаломлення, густину. Якщо виділена тверда речовина, то визначають температуру плавлення і при необхідності проводять перекристалізацію.

Розподільна хроматографія. Розподільна хроматографія полягає у фракційному розділенні суміші, компоненти якої мають різні коефіцієнти розподілу між двома розчинниками, що не змішуються.

Як носій, як правило, застосовують силікагель, рідше крохмаль, клітковину, оскільки вони володіють невеликою адсорбцією до багатьох речовин.

Одним з розчинників просочують твердий носій, але так, щоб він здавався на вигляд все ще сухим. Цей розчинник називається нерухомим. Досліджувану суміш розчиняють (або суспендують) в другому розчиннику, який називається рухомим, і пропускають рівномірно розчин (або рідку кашку) через колонку (рис. 56).

Рис. 56. Прилад для розподільної хроматографії: 1 – розчинник; 2 – пробка з вати; 3 – силікагель: 4 – пробірки для збирання елюата.

Після того, як розчин вбереться, колонку промивають чистим рухомим розчинником до тих пір, поки компоненти суміші речовин не утворюють у колонці зони або поки речовини не опиняться в розчиннику, що капає з нижнього кінця колонки (це виявляють специфічними реакціями). Потім компоненти послідовно елюють і у міру вимивання зон збирають фракції елюата в різні приймачі. Розчинник з фракцій видаляють перегонкою або випаровуванням, виділяючи чисті речовини.

На відміну від адсорбційної хроматографії розподільна хроматографія особливо придатна для розділення близьких членів гомологічних рядів, відмінних головним чином розчинністю.

Хроматографія на папері. Окремий випадок розподільної хроматографії – хроматографія на папері, що використовується головним чином для якісного аналізу сумішей органічних речовин. Цей вид хроматографії виконується вельми просто і до того ж з дуже малими кількостями речовин.

Як носій для нерухомого розчинника застосовують чисту целюлозу у вигляді спеціального фільтрувального паперу. Вона повинна володіти високою чистотою і рівномірною густиною. Нерухомим розчинником у паперовій хроматографії в більшості випадків є вода, завжди присутня у фільтрувальному папері. Проте нерухомою фазою на папері може бути і інший розчинник. Як рухомі розчинники найчастіше використовують бутиловий і аміловий спирти, фенол, крезоли, ізомасляну кислоту або їх суміші, заздалегідь насичені водою.

Техніка паперової хроматографії полягає в наступному: краплю розчину досліджуваної суміші наносять на папір і висушують. Потім папір поміщають у закриту судину, в якій вона безперервно змочується розчинником. Цей розчинник рівномірно рухається по паперу в одному напрямі, при цьому речовини, що входять до складу досліджуваної суміші, переміщаються по паперу в тому ж напрямі з різною швидкістю, утворюючи окремі зони або плями. Для отримання добрих результатів при хроматографуванні на папері необхідно дотримувати наступні умови: застосовувати дуже чисті розчинники; наносити плями розміром 0,5 – 1 см при великих дозах і 0,2 см при малих; забезпечити газонепроникність хроматографічної камери і насичення її парами обох фаз; підтримувати під час досліду постійну температуру, щоб не відбувалося розшарування фаз рідини; дотримувати чистоту, щоб уникнути забруднення вологих хроматограм сторонніми домішками при їх переміщенні.

Ідентифікація кожного компоненту суміші по забарвленій плямі проводиться на підставі розрахунку величини коефіцієнта розподілу R_f. Коефіцієнт розподілу характеризується відношенням відстані х (мм), пройденої речовиною від лінії нанесення речовини (лінія старту) до центру плями, до відстані у (мм), пройденої розчинником від тієї ж лінії старту до фронту розчинника. Значення R_f обчислюють за формулою:

Коефіцієнт розподілу для кожної сполуки є характерною величиною. Для великого числа речовин значення R_f приведені в спеціальних таблицях, тому легко можна визначити, якій речовині відповідає знайдена величина. Значення R_f істотно залежать від температури, розчинника, якості паперу і інших чинників. Тому при ідентифікації речовини слід для порівняння паралельно хроматографувати пробу чистого препарату цієї ж речовини – «свідка». За цим способом на відстані 3 – 4 см по ту і іншу сторону від краплі суміші на тій же лінії старту наносять краплі «свідка». Після хроматографування і виявлення плям зіставляють положення плям компонентів досліджуваної суміші з положенням плям «свідка». Відомі різні способи здійснення паперової хроматографії, що характеризуються тією або іншою технікою виконання: висхідна хроматографія, низхідна хроматографія і кругова хроматографія.

Найпростіший випадок хроматографії на папері – висхідна хроматографія з водою (нерухомий розчинник). Вона полягає в наступному. Вирізують смужку фільтрувального паперу, відповідну розмірам циліндра який використовується для хроматографії (як правило смужку вирізують шириною 15 – 30 мм і завдовжки 300 – 500 мм). На відстані 3 см від нижнього краю смуги паперу проводять олівцем лінію старту. На цій лінії на відстані 2 – 2,5 см один від одного і від країв смужки позначають крапками діаметром 3 мм точки старту. Досліджуваний розчин речовини у воді або легколеткому розчиннику повинен мати приблизно 1%-ну концентрацію по відношенню до кожного компоненту суміші. За допомогою спеціальної піпетки або капіляра наносять у кожну точку старту краплі досліджуваної речовини. Потім наливають рухомий розчинник на дно циліндра (висота шару ~2 см), підвішують висушену смужку так, щоб вона не торкалася ні стінок, ні рідини (рис. 57), і залишають на ніч для насичення атмосфери циліндра парами даного розчинника.

Рис. 57. Проведення висхідної хроматографії на папері: 1 – папір до хроматографії; 2 – папір після хроматографії; 3 – прилад для проведення висхідної хроматографії; А – лінія старту; Б – межа фронту розчинника; В – розчинник.

Наступного дня нижній край смужки занурюють на 0,5 см у рухомий розчинник, який протягом 12 – 18 год. під дією капілярних сил підіймається вгору приблизно на 20 – 25 см. Потім виймають смужку, відзначають олівцем верхню межу фронту розчинника і висушують хроматограму. Якщо плями не забарвлені і не флуоресціюють в ультрафіолетовому світлі, їх проявляють, обприскуючи з пульверизатора реактивами-індикаторами, що дають фарбування з відповідними компонентами.

Іонообмінна хроматографія. Іонообмінна хроматографія основана на обміні між іонами, що знаходяться в розчині, і іонами деяких поглиначів, так званих іонітів. Прикладами таких речовин можуть бути сульфоване вугілля, поліметакрилова кислота, продукти конденсації різних заміщених фенолів і амінофенолів з формальдегідом і ін. Багато іонітів застосовуються як у водному середовищі, так і в органічних розчинниках. Перед використанням їх подрібнюють і піддають очищенню, для цього послідовно обробляють іоніт кислотою і лугом. Отриманий чистий і сухий іоніт суспендують у воді і наповнюють ним хроматографічну колонку, як вказано вище. Через цю колонку пропускають розчин досліджуваної суміші із швидкістю 1 мл/хв. Потім проявляють хроматограму шляхом елюювання.

Іонообмінна хроматографія має велике значення для дослідження споріднених сполук і застосовується в основному в аналітичній хімії.

ЛЕКЦІЯ 4. ВИЗНАЧЕННЯ НАЙВАЖЛИВІШИХ КОНСТАНТ ХІМІЧНИХ СПОЛУК

Для ідентифікації хімічних речовин і доказу чистоти тієї або іншої речовини використовують методи визначення фізичних констант сполук. Найчастіше для з'ясування ступеня чистоти кристалічної речовини достатньо визначити температуру її плавлення, а для рідини – густину, температуру кипіння і показник променезаломлення.