Етапи одержання гібридоми:

1. Імунізація мишей антигеном, проти якого потрібно одержати антитіла.

2. Виділення клітин селезінки імунізованих тварин.

3. Одержання клітин мієломи у мишей, поражених цією пухлиною.

4.   Злиття клітин селезінки з клітинами мієломи.

Для злиття (гібридизації) двох клітин використовують три методи: біологічний (з допомогою вірусів типу вірусу Сендай), хімічний (з допомогою речовин типу лізолецитину або поліетиленгліколю) і фізичний (з допомогою електричного поля).

5.   Тестування необхідних клітин і їх клонування .

6.   Культивування гібридом в організмі тварин або в культуральних середовищах.

7.   Очистка гібридомних антитіл.

 

 

 

 

 

 

 Моноклональні антитіла, як правило, важче візуалізуються при зв’язуванні з антигеном. Дуже рідко моноклональні антитіла здатні викликати преципітацію або аглютинацію антигена. Це пояснюється тим, що вони спрямовані проти єдиної антигенної детермінанти, яка може бути представлена на клітині чи молекулі в невеликій кількості повторів.

Генно-інженерні моноклональні антитіла- це більш високий стан гібридомної техніки, при якому в пухлинну клітину вводиться чистий екзогенний ген, сконструйований за певною потребою. Природна властивість антитілосинтезуючих клітин мати при складанні молекули вільну комбінацію поліпептидних ланцюгів, синтезованих на різних хромосомах, може бути використана для одержання такої молекули антитіла, яка складається з двох половин від різних антитіл з активними центрами для різних антигенів. Таким чином одержують біспецифічні антитіла, що мають два різних активних центри. Ц. Мільштейн разом з А. Куелло одержували такі біспецифічні антитіла, створивши гібрид з двох різних гібридом. Цей гібрид вони назвали квадромою.

 Комбіновані препарати із декількох моноклональних антитіл можна одержати і хімічним шляхом.

Третій варіант антитіл (крім правильних природніх і вищезгаданих комбінованих вздовж і поперек), які можна одержувати з гібридом, це мутантні антитіла. В гібридомах з великою вірогідністю реалізується  можливість різноманітності антитіл за рахунок соматичних мутацій. Такі клітини, знаходячись поза організмом,  не зазнають негативного впливу імунологічного нагляду і живуть практично безкінечно довго.

 Гібридоми являються чудовим обєктом для вивчення молекулярної генетики, структури і функцій імуноглобулінів, разом з моноклональними антитілами вони є моделлю для дослідження механізмів імуногенезу.

 

Сфера застосування моноклональних антитіл.

1.   Ідентифікація і очистка молекул і клітин, які несуть специфічний антиген.

2.   Діагностика в наступних методичних варіантах: імуноаналіз біологічних рідин і клітин організму типу РІА, ІРМА, ІФА, імунофлюоресценції, мікроцитофлюорометрії, мікроскопії, імунодифузії, імуноелектрофорезу, імуноблотінгу та інш . Випускається декілька сотень комерційних діагностикумів на основі моноклональних антитіл для імуногістохімії, імуносканування, типування груп крові і тканин.

3.   Лікування: екстракорпоральна обробка тканин ( частіше кісткового мозку при трансплантаціях ); введення вільних антитіл  in vitro або  in vitro антитіл, зв’ язаних з лікарськими речовинами ( імунотоксин ).

4.   Дослідження етіології й патогенезу різних захворювань.

Моноклональні антитіла широко вокористовуються для індикації мікроорганізмів. Широкі панелі моноклональних антитіл одержані проти: вірусу японського енцефаліту, парвовірусів, різних антигенів вірусу грипу (нейрамінідази, гемаглютиніна, нуклеопротеїду, матриксного білка), вірусу жовтої гарячки, цитомегаловіруса, малярійного плазмодія, грибків кандіда, холерного токсину, капсульного антигена збудника чуми і багато інших.

Показана в багатьох роботах доцільність одержання імунологічних реагентів проти загальних для великих таксономічних груп антигенів. Наприклад, при імунізації непатогенними штамами  E. coli одержано антитіла до детермінанти із 1-5 ділянки молекули ліпополісахариду. Виявилось, що ці антитіла захищали мишей від летальних інфекцій таких мікробів як патогенна E.coli, S. typhi, K. pneumonia,  P. aeruginosa, N. meningitidis, H. influencae. З цього прикладу видно, що багато збудників мають спільні антигенні ділянки, що заважає точній діагностиці, в той же час воно допомагає створити протективний імунопрепарат проти патогенних збудників, використовуючи для імунізації непатогенні штами мікробів.

 Описані протективні моноклональні антитіла до антигенів вірусу жовтої гарячки, вірусу простого герпеса, поверхневих антигенів вірусу гепатита В.

 Одержані людські гібридомні антитіла до правцевого і  ботулінового токсинів.

 У протиінфекційному імунітеті мають значення не тільки антитіла проти мікробних антигенів, але й антитіла до тих структур на поверхні клітини, через які мікроби проникають всередину: вірус СНІДу через молекулу СD 4 на Т-лімфоцитах,  вірус Епштейна Барр- С3q, реовірус міокарду - - адренергічні рецептори на клітинах міокарду, вірус сказу- рецептори для ацетилхоліну, тощо.

 На великій групі риновірусів людини встановлено, що більшість з них має загальний рецептор на  клітинах мішенях. За цієї причини одне людське моноклональне антитіло до цього рецептора виявилось здатним блокувати звязування з клітинами 78 із 88 серотипів досліджуваних риновірусів.

 Моноклональні антитіла широко використовуються в клініці для діагностики і терапії.

Застосування в онкології. Діагностика онкологічних захворювань методами імуноаналізів проб сироваток та інших біологічних рідин можлива в тих випадках, коли специфічні пухлинні антигени відокремлюються від клітин і попадають в кров. Одержано моноклональні антитіла, що дозволяють виявляти специфічний клітинний компонент дрібноклітинного раку легень, гастроінтестінального раку, меланоми, раку передміхурової залози і інш.

Існує цікавий приклад виявлення з допомогою моноклональних антитіл незвичайного антигена, названого В5 на еритроцитах хворих різними пухлинами. Після радикального хірургічного втручання він зникав з еритроцитів, хоч до операції його знаходили у 85 % хворих. Моноклональні антитіла використовують для імунологічної діагностики раку молочної залози, гастроінтестінального і колоректального раків, меланом, нейробластом тощо, а також для радіомунолокалізації пухлин і метастазів (радіоімуносканування).

Моноклональні антитіла застосовують для знищення в крові , у кістковому мозку лейкозних клітин. Для цього антитіла конюгуютть з клітинними токсинами, одержуючи імунотоксини.

Моноклональні антитіла використовують для нейтралізації отрут і бактеріальних токсинів при важких отруєннях і інфекціях, для імуносупресії при трансплантації органів, для протипухлинної терапії.

Моноклональні антитіла знайшли застосування в гематології та кардіології. В лабораторіях є антитіла для типування практично всіх групоспецифічних антигенів еритроцитів людини: системи АВО, резус, Н, Левіс, N, Р і інш. Одержано антитіла й до компонентів плазми, до факторів згортання крові: VIII, С, ІХ, Х, фібрину, фібриногену і інш.

Моноклональні антитіла проти певних медикаментів застосовують для лікування ефекту передозування.

Використовують моноклональні антитіла в ендокринології (кількісна оцінка гормонів в біологічних рідинах), в акушерстві й гінекології для ранньої діагностики вагітності, диференціальної діагностики гіпо- і гіперпластичних, а також неопластичних змін в ендометрії, тощо.

Створено панелі моноклональних антитіл для визначення класів і субкласів імуноглобулінів людини і, практично, всіх субпопуляцій імуноцитів.