Руководство по иммунофармакологии / 013306

				Экспериментальные модели для тестирования							233
	ходится на 48-й час), причем в нем домини-				суставов. Затухание сильного воспаления про-
	руют мононуклеарные клетки.				исходит через 30-40 дней.
	Интересно, что данная модель является од-				Другие вещества, такие как небольшие
	ной из тех немногих, где показано подавление				фрагменты стенки клеток микобактерий и
	воспаления D-пеницилламином, индометаци-				мурамилдипептид, могут индуцировать забо-
	ном и левамизолом. Введение до сенсибилиза-				левание при введении эмульсии, приготовлен-
	ции и продолжение терапии этими тремя пре-				ной на неполном адъюванте Фрейнда, под кожу
	паратами во время развития воспаления вызы-				стопы.		СР-20961[N,N-диоктадецил-N',N-бис(2-
	вает подавление реакции. С другой стороны,				оксиэтил)-пропаредиамин]				-	неиммунный
	введение D-пеницилламина и левамизола од-				синтетический адъювант, суспендированный в
	новременно с разрешающей дозой антигена				парафиновом масле, может индуцировать хро-
	усиливает реакцию, а введение индометацина				нический артрит, аналогичный наблюдаемому
	ее подавляет. Таким образом, остается нере-				при введении других адъювантов.
	шенной проблема выбора модели, способной				Животными выбора являются 13-30-дневные
	давать позитивные результаты с разными				крысы. Адъювантные артриты различаются у
	группами клинически используемых препара-				разных линий, и наиболее удобными являются
	тов для лечения артрита.				инбредные крысы Льюис.
					Этиология адъювантного артрита неизвест-
	Реакциясмешаннойгиперсенситивностив				на, но косвенные данные свидетельствуют о
	шестидневном воздушном пузыре				наличии		неидентифицированных			антигенов,
	Смешанные реакции гиперсенситивности мо-				которые, активируясь, усиливают Т-клеточный
					иммунитет и вызывают воспаление в тканях
	гут быть индуцированы в 6-дневном воздуш-				сустава. Это также подтверждается фактом
	ном пузыре с помощью вакцины Bordetella				переноса		заболевания	сенсибилизированными
	pertussis. Крыс сенсибилизируют коклюшной				лимфоцитами.
	вакциной в неполном адъюванте Фрейнда, а				Роль простагландинов установлена при вы-
	спустя 6 дней на дорсальной поверхности жи-				явлении чувствительности модели к ингибито-
	вотных формируют воздушный пузырь. На 6-й				рам	циклооксигеназного			пути	метаболизма
	день развития воздушного пузыря или на 12-й				арахидоновой кислоты. Воспаление, индуциро-
	день сенсибилизации в его полость вводят				ванное адъювантами, также эффективно по-
	коклюшную вакцину. Реакция начинается с				давляется стероидами. Действие других препа-
	проникновения полиморфно-ядерных клеток, а				ратов в значительной степени зависит от дозо-
	затем мононуклеарных клеток. Эйкозанои-ды,				вого	режима. Белки		острой фазы, например
	простагландин Е2		и лейкотриен В4	опре-	аггликопротеин, используются в качестве био-
	деляются в экссудате вплоть до 13-го дня после				логического маркера воспаления, индуциро-
	введения разражителя. Блокаторы циклоокси-				ванного адъювантами. Данный показатель
	геназы способны подавлять эту реакцию, a D-				снижается при применении нестероидных про-
	пеницилламин обладает потенцирующим дей-				тивовоспалительных препаратов и стероидов.
	ствием. Дексаметазон полностью подавляет
	реакцию.				Артриты крыс, вызванные коллагеном
	Адъювантный артрит				II типа
					Данная модель основана на использовании
	Основной моделью адъювантного артрита яв-
					нативного коллагена II типа, полученного из
	ляется введение убитых прогреванием Myco-				эмбрионов цыплят или человека и тщательно
	bacterium	tuberculosis, суспендированных в			эмульгированного в			неполном		адъюванте
	жидком парафиновом или минеральном масле,				Фрейнда. Эмульсию вводят внутрикожно в не-
	в заднюю лапу или в хвостовую кость. После				сколько мест или подкожно в заднюю лапу или
	инъекции указанного материала в лапу в тече-				хвост. Коллагениндуцированные артриты также
	ние 3 дней развивается неспецифический вос-				зависят от линии используемых животных.
	палительный отек, который сменяется имму-				Появление артритов наблюдается через 12-13
	нологически индуцированным отеком			другой	дней после разрешающей инъекции, а пик раз-
	лапы, в которую ничего не вводили. Между 16-				вития воспаления приходится на 21-28-й день
	м и 30-м	днем наблюдается максимальный			после сенсибилизации коллагеном. Воспаление

отек, приводящий к срастанию поверхностей

234 Глава 22

остается на одном уровне или постепенно уменьшается с 28-го по 50-й день.

Точный механизм развития коллагенового артрита неясен, но поскольку в нем участвует процесс иммунизации потенциальными аутоантигенами (коллаген II типа), то представляется вероятным, что в заболевании важную роль играет иммунитет к нативным коллагено-вым молекулам. Артриты, вызванные коллагеном II типа, успешно подавляются нестероидными противовоспалительными препаратами и стероидами.

Моносуставныеартриты

Каррагенан, зимозан и многие другие раздражающие вещества при введении в полость

сустава вызывают моноартрит. Хронические воспалительные реакции индуцируются лишь многократными инъекциями.

23 Хромогликат

Дж. К. Формен, Ф. Л. Пирс (J. С. Foreman, F. L. Pearce)

Разработка и клинические		тов, эффективно применяемых при астме (на-
эффекты хромогликата		пример, от B2-адреномиметиков и кортикосте-
Использование хромогликата как антиаллер-		роидов), отсутствием действия при использо-
		вании после введения антигена, тогда как по-
гического препарата было начато в Великобри-		следние эффективны после антигена.					некоторых
тании в 1967 г. Препарат (рис. 102) разработан		Хромогликат		эффективен		при
на основе хромона (келлина), выделенного из		аллергических заболеваниях, отличных от аст-
семян восточно-средиземноморского растения		мы, например при аллергическом рините, ато-
Amni visnaga. Келлин обладает сосудорасши-		пических заболеваниях глаз. Он также эффек-
ряющим действием и расслабляет гладкие		тивен при формах астмы, не имеющих аллер-
мышцы, но его применение ограничено ввиду		гической основы, включая астму, индуциро-
побочных токсических эффектов. Хромогликат		ванную физической нагрузкой, и неатопиче-
служит примером препарата, действие которого		скую или криптогенную астму. Активность
было открыто при использовании у людей, а не		хромогликата не зависит от аллергии к какому-
в результате рациональной экспериментальной		либо особому антигену. Показано, что хро-
работы на животных моделях. Анти-		могликат	предупреждает		как	аллергическую
астматический эффект хромогликата был об-		астму, опосредованную классическим взаимо-
наружен Altounyan, который ввел себе препарат		действием IgEантиген (см. главу 2), так и аст-
во время астматического приступа, вызванного		му, опосредованную взаимодействием IgG-
ингаляцией пыльцевых антигенов, к которым		антиген.
он был сенсибилизирован. Ингаляция 20 мг
хромогликата обеспечивает 90% защиты от		Астма и клиническая фармакология
вызываемой антигеном обструкции дыха-
тельных путей, если препарат принимается за 2		хромогликата
ч до антигена. Эффективность препарата		Неотъемлемой характеристикой всех больных
уменьшается по мере увеличения промежутка
времени между его приемом и введением анти-		астмой является гиперреактивность дыхатель-
гена, но даже при увеличении этого промежут-		ных путей как к специфической стимуляции
ка до 18 ч некоторая активность лекарства		антиген/антитело, так и к неспецифическим
сохраняется.		стимулам,	включая химические				соединения
Хромогликат не всасывается после приема		(например, гистамин, метахолин и двуокись
внутрь и эффективен только при попадании на		серы), а также к охлаждению.				аллергеном у
слизистую оболочку бронхов при ингаляции.		Бронхиальная		провокация
Хромогликат отличается от других препара-		больных	аллергической		астмой		вызывает
		бронхоконстрикцию, обычно определяемую как
		снижение объема форсированного выдоха за 1 с
		(OBФ1); причем эта реакция может быть
		двухфазной (рис. 103). Реакция на аллерген с
		немедленным началом и разрешением через 1-2
		ч сменяется в некоторых случаях поздней
		реакцией, начинающейся через 4-6 ч после
		провокации аллергеном и длящейся несколько
		часов. Хромогликат предупреждает как немед-
		ленную, так и позднюю реакции (см. рис. 103).
		Общепринято, что немедленная реакция
		вызывается медиаторами, выделяемыми туч-
Рис. 102. Структура хромогликата.

235

236 Глава 23

Рис. 103. Влияние хромогликата на раннюю и позднюю фазы бронхиальной реакции у больного с аллергией к домашним полевым клещам.

ными и другими клетками. Механизм поздней реакции и ее взаимоотношения с ранней реакцией пока непонятны. У некоторых больных выявляется только поздняя или только ранняя реакция, поэтому невозможно утверждать, что события немедленной реакции необходимы для формирования поздней. Возможно, что медиаторы обеих реакций образуются во время поступления аллергена. Одни медиаторы, например гистамин (см. главу 9) и метаболиты арахидоната (см. главу 10), вызывают немедленные эффекты, а другие, такие как ФАТ, обладают отсроченным действием. Проявления немедленной или поздней реакции определяются количествами каждого типа медиатора, образованным любым данным стимулом. Как будет сказано ниже, получены доказательства того, что хромогликат предупреждает выделение медиаторов, вызывающих немедленную реакцию (гистамин), но это не означает, что он предупреждает выделение медиаторов поздней реакции. Есть данные, что хромогликат отменяет некоторые эффекты ФАТ (см. главу 16). Таким образом, противоастматическое действие хромогликата может складываться из нескольких механизмов.

Ингаляция хромогликата в настоящее время принята в качестве надежного метода лечения астмы, индуцированной физической нагрузкой. Одним из важных начальных событий при данном виде астмы является сужение бронхов вследствие охлаждения дыхательных путей. Оно возникает в результате увеличенной потери тепла и латентного тепла испарения

при гипервентиляции, сопровождающей нагрузку. Величина этого эффекта зависит от природы, интенсивности и длительности нагрузки, т. е., в конце концов, от частоты и глубины вентиляции, а также от температуры и влажности вдыхаемого воздуха. Механизм, посредством которого охлаждение дыхательных путей вызывает бронхоспазм, неизвестен. Возможно, что охлаждение гиперреактивных дыхательных путей само по себе вызывает сокращение гладких мышц за счет прямой или непрямой стимуляции сенсорных рецепторов и последующей активации суживающих рефлексов блуждающего нерва. Альтернативно охлаждение может приводить к выделению из тучных клеток таких медиаторов, как гистамин, что наблюдается при холодовой крапивнице. Дополнительно к охлаждению при испарении потеря воды со слизистой оболочки бронхов может привести к образованию гиперосмолярной среды в тканях, что либо прямо вызовет выделение медиаторов, либо усилит реакцию дыхательных путей на иммунную стимуляцию тучных клеток легких.

При астме, индуцированной физической нагрузкой, как у больных с аллергической формой заболевания, так и у астматиков-неаллергиков отмечается выделение в плазму медиаторов тучных клеток-гистамина и хемотаксиче-ского фактора нейтрофилов (см. главу 11). Выявлена корреляция между временем появления этих медиаторов и развитием бронхоспаз-ма, а также между их концентрацией и силой бронхоспазма. Лечение таких больных хромо-

гликатом перед нагрузкой предупреждает как развитие бронхоконстрикции, так и выделение указанных медиаторов. Отсюда сделано заключение, что действие хромогликата связано с предупреждением выделения медиаторов тучными клетками; однако имеются сообщения об индуцированной физической нагрузкой астме, приступы которой не сопровождаются увеличением в плазме гистамина; но и в этом случае заболевание можно было предупредить хромогликатом.

Выше отмечалось, что хромогликат обладает разными механизмами действия на немедленную и позднюю фазы астматической бронхоконстрикции. Более того, выявлена дивергентность кривых доза-эффект для хромогликата как профилактического средства при бронхоконстрикции, вызванной антигеном, и при астме, индуцированной двуокисью серы. Это также свидетельствует в пользу того, что хромогликат действует посредством разных механизмов в зависимости от природы стимула (специфический, аллергический или неспецифический).

Важно отметить, что хромогликат не обладает бронхорасширяющей, противовоспалительной или антихолинергической активностью. Он также не является антагонистом гистамина или других медиаторов острых аллергических реакций. Помимо возможного влияния хромогликата на выделение медиаторов предполагается (по данным последних исследований) его действие на нервные механизмы, принимающие участие в астме.

Действие основного констрикторного механизма в дыхательных путях обеспечивается холинергической парасимпатической нервной системой. Дыхательные пути человека получают обильную холинергическую иннервацию через блуждающий нерв, синапсы эфферентных волокон которого находятся в ганглиях, локализующихся в стенках дыхательных путей. Электрическая стимуляция блуждающего нерва у животных вызывает сужение просвета бронхов, которое частично блокируется мускариновым антагонистом атропином или ганглиоблокатором гексаметонием. Среди бронхолегочных афферентных волокон, проходящих в блуждающем нерве, находятся волокна, идущие от ирритантных рецепторов эпителия трахеи и бронхов. Эти рецепторы стимулируются гистамином и, возможно, другими медиаторами анафилаксии и вызывают рефлекторную бронхоконстрикцию, которая блокируется пересечением блуждающего нерва или атропи-

Хромогликат 237

ном. Этот эффект был детально изучен на собаках, у которых при анестезии хлоралозой ингаляция гистамина приводила к выраженному повышению сопротивления дыхательных путей. Данный эффект индуцируется также прямой электрической стимуляцией эфферентных вагусных нервов и подавляется охлаждением блуждающего нерва до возникновения блока проводимости. Более того, хромогликат ослабляет бронхоконстрикцию, вызванную гистамином, но не действует на бронхоспазм, обусловленный прямой электрической стимуляцией вагуса. Сначала это действие препарата связывали с десенситизацией ирритантных рецепторов легких. Аналогичный механизм предлагается для объяснения защитного действия хромогликата при бронхоспазме, вызванном двуокисью серы у людей. Однако электрофизиологическая регистрация с одиночных волокон, идущих от ирритантных рецепторов легких у собак, не выявила какого-либо влияния хромогликата ни на фоновые разряды, ни на разряды, индуцированные гистамином. Напротив, препарат повышает скорость разрядов рецепторов, расположенных в эндокарде левого желудочка сердца собак. На этом основании утверждается, что ирритантные легочные рецепторы у собак, которые стимулируются гистамином (а возможно, и другими стимулами), вызывают бронхоспазм, а рецепторы левого желудочка, чувствительные к хромогликату, подавляют их рефлекторное действие. Пока неясен механизм, посредством которого активация последних рецепторов предупреждает или отменяет бронхоконстрикцию. Вероятно, повышенная активность рецепторов левого желудочка подавляет активность центральной нервной системы, которая связана с рефлекторными бронхоконстрикторными механизмами

встволе мозга.

Вболее поздних исследованиях определялось действие хромогликата на волокна миелинизированных афферентных нервов (С-волок- на), связанных с чувствительными нервными окончаниями в легких собак. Стимуляция этих окончаний капсаицином вызывает рефлекторную бронхоконстрикцию, а хромогликат подавляет возбуждение. Возможно, что хромогликат подавляет рефлекторные бронхоконстрикторные реакции, возникающие при стимуляции С-волокон или соответствующих чувствительных рецепторов в легких человека. Независимо от точных механизмов данного процесса, кажется вполне вероятным, что превентивное действие хромогликата при астмати-

238 Глава 23

ческих реакциях на неспецифические стимулы опосредуется нейрофизиологическими механизмами.

Таким образом, обсуждается в основном профилактика хромогликатом бронхоспазма, вызванного специфическими или неспецифическими стимулами. Как уже отмечалось, ведущей патологией при астме является гиперреактивность дыхательных путей к различным агентам. В связи с этим возникает вопрос, каким образом хромогликат изменяет реактивность дыхательных путей. Здесь могут рассматриваться как влияние хромогликата на выделение медиаторов, так и его действие на нервные пути. Существуют сведения о том, что хромогликат снижает чувствительность дыхательных путей к гистамину, но, поскольку он не обладает активностью антагониста гистаминовых рецепторов, предполагается, что его действие связано с уменьшением реактивности дыхательных путей. Эта идея должна быть рассмотрена критически, так как не во всех исследованиях получены результаты, подтверждающие ее правильность.

Исследование механизма действия хромогликата на экспериментальных моделях in vivo

Уникальная превентивная активность хромогликата в отношении аллергической астмы первоначально была выявлена у человека. Подобный подход не может быть использован для поиска новых препаратов, поэтому для таких целей разработан ряд животных моделей.

Респираторнаяанафилаксия

Респираторная анафилаксия у человекообразных приматов служит моделью бронхиальной астмы человека. Обезьяны, сенсибилизированные к антигену Ascaris, реагируют на последующую ингаляцию аэрозольного антигена выраженным ухудшением некоторых функций легких - скорости потока воздуха, объема дыхания, транслегочного давления, общего легочного сопротивления и динамической податливости легких.

Вызванные антигеном нарушения легочных функций у сенсибилизированных обезьян в том же исследовании ослаблялись хромогликатом. Однако эти результаты не были подтверждены всеми последующими исследованиями, хотя

в данной системе отмечена активность других, более сильных хромогликатоподобных препаратов. Причина такого несоответствия непонятна и, возможно, связана с условиями иммунизации экспериментальных животных. Несмотря на эти различия, совершенно очевидно, что изучение дыхательных функций на экспериментальной модели приматовнаиболее доступное и адекватное исследование для определения потенциальной антиастматической активности соединений. Ввиду технических трудностей и высокой стоимости эксперимента с использованием приматов вряд ли можно считать данную систему пригодной для начального скрининга новых антиастматических препаратов.

Для изучения дыхательной анафилаксии широко используются морские свинки и крысы. У крыс после активной или пассивной сенсибилизации определяется бронхоконстрикция. В последней системе хромогликат, как правило, более эффективен в предупреждении повышения резистентности дыхательных путей и оказывает довольно слабое действие у активно сенсибилизированных животных. Причины этого не вполне понятны, но они могут отражать различия механизмов, участвующих в развитии бронхоконстрикции в обоих случаях. В отличие от крыс влияние хромогликата на анафилактическую бронхоконстрикцию у морских свинок менее выражено. В первых исследованиях было обнаружено, что хромон в подобной системе неэффективен. В более поздних работах препарат в определенных условиях частично ослаблял реакции, опосредованные IgE-антителами, но не влиял на реакции, опосредованные IgG. Сниженная активность хромогликата в данной системе почти наверняка отражает видовую и тканевую специфичность хромона. Тучные клетки морских свинок оказались достаточно рефрактерными к данному соединению. Аналогично этому, препарат не предупреждает острой системой анафилаксии у телят, сенсибилизированных сывороткой лошади, причем легкие у телят являются главным шоковым органом. Препарат обладает слабым и непостоянным действием на респираторные реакции у собак.

Пассивнаяперитонеальнаяанафилаксияу

крыс

Для создания данной модели сначала производят пассивную сенсибилизацию тучных клеток перитонеальной полости крыс внутрибрюшин-

				Хромогликат		239
ной инъекцией IgE-антител. Последующее вве-				Затем животное забивают и удаляют кожу
дение соответствующего антигена приводит к				спины для исследования подкожного слоя.
высвобождению медиаторов тучных клеток,				Экстравазация маркера устанавливается		путем
таких как гистамин и леикотриены. После об-				определения диаметра отечных поражений или
наружения этих веществ в перитонеальной				при экстракции с последующим спектрофото-
жидкости их стали использовать как показатель				метрическим определением красителя. Альтер-
активации тучных клеток. Затем метод				нативно экстравазацию можно определить с
модифицировали, вводя внутривенно животным				помощью радиоактивного	высокомолекуляр-
маркер (краситель) перед внутрибрюшин-ным				ного маркера. Исследуемые препараты обычно
введением антигена. Последующее попадание				вводят внутривенно или (когда возможно) пе-
красителя в перитонеальную полость может				рорально вместе с антигеном и маркером.
использоваться как показатель воспаления в				Хромогликат относится к очень сильным и
брюшной полости. Инъекция хромогли-ката				эффективным ингибиторам реакций ПКА (у
непосредственно перед нагрузкой			антигеном	крыс), опосредованных гомологичными IgE-
почти	полностью	подавляет	выделение	антителами. Как и в других системах тести-
гистамина и несколько уменьшает проникнове-				рования, активность препарата варьирует в об-
ние красителя, а также выделение лейкотрие-				ратной зависимости от силы анафилактической
нов. Основной трудностью в интерпретации				реакции, но оптимальные концентрации
результатов является изменение концентрации				хромогликата могут полностью отменять ре-
выделившихся медиаторов, которое определя-				акцию. Однако кожные реакции, опосредован-
ется не только скоростью их выделения, но и				ные IgG-антителами, труднее подавляются
скоростью их удаления из брюшной полости				данными соединениями. Как и в моделях in
вследствие абсорбции и метаболизма. Тем не				vitro, активность хромогликата в модели ПКА
менее данный метод дополнительно позволяет				крыс резко снижается, если антиген и препарат
оценить действие препаратов на воспаление в				не вводят одновременно. Этот эффект связан с
брюшной полости в результате активации				генуинной тахифилаксией, поскольку вторая
тучных клеток. Экстравазация серозной жид-				доза хромона, введенная одновременно с анти-
кости в просвет бронхов больных астмой вносит				геном, не подавляет реакции. Другие антиал-
определенный вклад в патогенез заболевания,				лергические препараты могут обладать подоб-
поэтому препараты, влияющие на данный				ными тахифилактическими свойствами, а также
процесс, могут иметь клиническую ценность.				перекрестной реактивностью с хромоглика-том,
Однако степень достоверности, с которой ак-				т. е. первая доза одного соединения может
тивность препаратов, подавляющих перитоне-				подавлять активность последующей дозы вто-
альную анафилаксию у крыс, прогнозирует				рого соединения. Определение перекрестной
подобную активность у человека, достаточно				тахифилаксии с хромогликатом принято в ка-
ограничена.				честве критерия оценки сходства механизма
				действия с хромоном исследуемого соединения
Пассивная кожная анафилаксия				и может свидетельствовать о потенциальной
Опосредованные IgE реакции пассивной кож-				антиастматической активности.
				На первый взгляд, модель реакции ПКА
ной анафилаксии (ПКА), особенно у крыс,				крыс имеет много явных преимуществ в каче-
очень широко используются для первичного				стве скрининговой модели	антиаллергических
скрининга антиаллергических соединений. В				соединений. Она быстровыполнима, проста, и с
этой модели воспалительные медиаторы, вы-				ее помощью можно исследовать большое
свобождаемые в результате реакции гиперсен-				количество препаратов. Однако метод зависит
ситивности немедленного типа в коже, вызы-				от способности исследуемых соединений по-
вают локальное повышение проницаемости ка-				давлять дегрануляцию тучных клеток кожи
пилляров. Ее измерение позволяет установить				крыс. Учитывая гетерогенность реакций тучных
интенсивность кожной анафилактической реак-				клеток на антиаллергические соединения,
ции. В модели обязательно используются внут-				трудно предопределить надежность экстрапо-
рикожное введение соответствующего количе-				ляции результатов, полученных в данной моде-
ства IgE-антител. После латентного периода				ли, на человека. Эта точка зрения будет де-
(24-72 ч), в течение которого наблюдается сен-				тально обсуждаться ниже, здесь же в под-
сибилизация тучных клеток кожи, животному				тверждение специфичности действия препарата
внутривенно вводят смесь антигена и маркера.				следует отметить, что хромогликат не по-

240	Глава 23
давляет кожные анафилактические реакции in				та подавляют выделение гистамина тучными
vivo у коров, морских свинок, людей, обезьян,				клетками, стимулированными антигеном, но не
мышей и кроликов. Если другие препараты				влияют на высвобождение медиатора под
обладают аналогичной специфичностью, то этот				действием кальциевого ионофора А23187 (см.
эффект может весьма серьезно ограничивать				главу 2). Эти данные свидетельствуют о том,
целесообразность любой экспериментальной				что хромогликат подавляет выделение гиста-
модели при прогнозировании антиастма-				мина, нарушая антигениндуцированный вход
тической активности соединений у людей.				кальция в тучные клетки, что и было показано
				для хромогликата, доксантразола (родственный
Исследование механизма действия				препарат) и дибутирила цАМФ. Активность
				указанных	соединений		как	ингибиторов
хромогликата in vitro				транспорта кальция была такой же, как и инги-
Подавлениевыделениягистамина				биторов выделения гистамина.
				Данная гипотеза представляется слишком
тучными клетками				простой: ведь если выделение гистамина туч-
				ными клетками		индуцируется		ионофором
Перитонеальные тучные клетки крыс активно				А23187, то ЕС50		хромогликата для его подав-
используются для изучения механизма действия				ления составляет 300 мкМ, а при использовании
хромогликата по следующим причинам: во-				в качестве стимула антигена и соединения
первых, выделение гистамина тучными клетками				48/8010 мкМ. Кроме того, против механизма
рассматривается как основная часть патогенеза				действия хромогликата, направленного на пре-
астмы; во-вторых, перитонеальные тучные				дупреждение изменений потоков кальция, при-
клетки крыс могут служить типичным примером				водятся данные о блокировании хромоглика-
изолированных тучных клеток, относительно				том выделения гистамина под действием сти-
легко получаемых в очищенном виде. Однако				мулов, не зависящих от внеклеточного кальция.
обнаружение гетерогенности тучных клеток (см.				Однако это не является обязательным условием.
главу 2) предполагает, что перитонеальные				Установлено, что выделение гистамина
тучные клетки крыс не всегда являются				тучными клетками зависит от возрастания
идеальной моделью тучных клеток легких				внутриклеточной		концентрации		ионизиро-
человека. Кроме того, накапливается все больше				ванного кальция (см. главу 2). Кальций имеет
данных о том, что роль тучных клеток в				либо внеклеточное происхождение, либо вы-
патогенезе астмы не столь значительна, как это				свобождается из внутриклеточного депо. Не
представлялось раньше. Тем не менее показано,				исключено, что транспорт кальция через кле-
что	хромогликат	подавляет	выделение	точную мембрану или через мембраны внут-
медиаторов из тучных клеток человека как in				ренних депо одинаков, поэтому хромогликат
vitro, так и in vivo, а исследования на				может нарушать оба процесса одним и тем же
перитонеальных тучных клетках крыс и				механизмом,	например		фосфорилированием
крысиных клетках базофильного лейкоза в на-				особых белков (см. ниже). Без всякого сомне-
стоящее время позволяют получать наиболее				ния, хромогликат подавляет выделение гис-
полную информацию о механизме действия				тамина тучными клетками, которое индуциру-
хромогликата на клеточном уровне.				ется ионофором, но этот факт сам по себе не
Хромогликат (1-100 мкМ) вызывает дозо-				отрицает возможного наличия разных меха-
зависимое подавление		выделения	гистамина	низмов влияния хромогликата на транспорт
перитонеальными тучными клетками, стиму-				кальция в тучных клетках и на некоторые
лированными реакцией антиген-антитело или				другие биохимические события, относящиеся к
соединением 48/80. Степень подавления выде-				потоку кальция и происходящие более дис-
ления гистамина под действием соединения				тально в секреторном механизме.
48/80, которая достигается при использовании				Тахифилаксия
хромогликата, при низком уровне стимуляции
явно выше, чем при высоком. Хромогликат				При изучении хромогликата как ингибитора
эффективен при его добавлении к тучным клет-
кам одновременно с антигеном; предваритель-				выделения гистамина тучными клетками отме-
ная преинкубация клеток с препаратом снижает				чено, что препарат более эффективен при его
эффект. По данным некоторых исследований,				использовании одновременно со стимулятором
определенные концентрации хромоглика-				процесса. Данный факт не совсем обычен,

поскольку многим препаратам для проявления их максимального ингибиторного эффекта требуется предварительная инкубация с тканью. Для хромогликата установлена обратная зависимость: сила подавления выделения гистамина уменьшаетсяс увеличением времени преинкубации с препаратом перед добавлением стимулятора. Это также контрастирует с клиническими наблюдениями при использовании хромогликата, который активен при введении за 2 и 18 ч до провокации бронхиальной астмы антигеном. На крысиных тучных клетках подавление хромогликатом выделения гистамина уменьшается в пределах преинкубационного времени 0-10 мин. При внесении хромогликата за 20 мин до стимуляции регистрируется лишь 75% эффекта, получаемого при внесении препарата одновременно со стимулом. При преинкубации клеток с препаратом более 20 мин ингибиторный эффект хромогликата вновь возрастает. Таким образом, минимальный ингибиторный эффект наблюдается в промежутке преинкубационного времени 10-20 мин. Интересно, что точно такой же феномен наблюдается при использовании хромогликата для подавления выделения гистамина из фрагментов легких крыс или при ингибировании пассивной кожной анафилаксии в коже крыс. Уменьшение ингибиторного действия хромогликата при увеличении времени преинкубации с тканями перед стимуляцией не связано с захватом, метаболизмом или другой инактивацией препарата, поскольку дополнительное внесение препарата в момент стимуляции тканей не вызывает усиления ингибиторного эффекта или отмены тахифилаксии, вызванной преинкубацией. Тахифилаксия, индуцированная хромогликатом, зависит и от концентрации препарата: более высокие концентрации вызывают и более сильную тахифилаксию.

После открытия хромогликата было разработано множество препаратов, подавляющих выделение гистамина тучными клетками in vitro и пассивную кожную анафилаксию. Примером подобных соединений могут служить доксантразол и буфролин. Показано, что некоторые из этих соединений обладают перекрестной тахифилаксией с хромогликатом, что указывает на общие механизмы их действия, а именно подавление выделения гистамина тучными клетками. Интересно, что флавоноид кверцетин, являющийся ингибитором выделения гистамина, также обнаруживает перекрестную тахифилаксию с хромогликатом. К сожалению, эти препараты не обладают аналогич-

Хромогликат 241

ной хромогликату клинической антиастматической активностью. Это свидетельствует о том, что действие хромогликата и данных веществ на тучные клетки крыс имеет мало общего с клинической эффективностью препарата.

Механизм тахифилаксии хромогликата неясен; известно, однако, что она не обусловлена инактивацией препарата. Предполагается, что хромогликат подавляет выделение гистамина, вызывая образование компонента, опосредующего ингибирование. В этом случае тахифилаксия должна отражать истощение этого эндогенного компонента, несмотря на присутствие препарата на его рецепторе. Одним из кандидатов на роль эндогенного компонента, образование которого вызывается хромогликатом, является фосфорилированный белок (см. ниже); в таком случае тахифилаксия отражает автоматическую дефосфориляцию белка в клетке в присутствии хромогликата.

Влияниенатранспорткальция: хромогликатсвязывающийбелок

В настоящее время получены убедительные доказательства индукции выделения гистамина клетками под действием возрастающих концентраций ионизированного кальция в цитозоле после взаимодействия антигена с мембранным IgE (см. главу 2). Увеличение концентрации обеспечивается, по крайней мере частично, перемещением внеклеточного кальция во внутриклеточный отсек. Как полагают, кальций перемещается по мембранным каналам, которые открываются при взаимодействии антигена и IgE на поверхности мембраны. Одна из ранних гипотез о механизме действия хромогликата заключается в том, что препарат предупреждает вход кальция в тучные клетки, стимулированные взаимодействием антигенIgE. В качестве доказательства приводятся данные исследований, в которых хромогликат предупреждает захват 45Са тучными клетками, стимулированными взаимодействием антигенIgE; причем активность препарата в отношении захвата 45Са сравнима с активностью препарата как ингибитора секреции гистамина этими клетками.

В последующем было показано, что хромогликат в органических растворителях образует комплексы с двухвалентными катионами, включая Mg, Ca, Sn, Ba, Zn и Мп. Эти комплексы образуются за счет электростатического взаимодействия двух карбоксильных групп хромогликата с двумя положительными заря-

242	Глава 23
дами двухвалентных ионов со стохиометрией				го свободного кальция. Данные варианты кле-
1:1. Однако захват кальция хромогликатом не				ток неспособны захватывать 45Са при стиму-
объясняет его активности как ингибитора вы-				ляции реакцией антигенIgE на мембране, где
деления гистамина по двум причинам: а) хро-				не выявляется белок, связывающий хромогли-
могликат подавляет выделение гистамина в				кат. Поэтому был сделан вывод о том, что
микромолярной		концентрации	в присутствии	хромогликатный рецептор мембраны представ-
миллимолярной		концентрации	внеклеточного	ляет собой транспортный белок кальция, кото-
кальция; б) у тучных клеток, обработанных				рый необходим для выделения гистамина при
хромогликатом, а затем отмытых от него,				стимуляции антигенIgE. Соответственно хро-
сохраняется подавление выделения гистамина.				могликат подавляет выделение гистамина, на-
Показано, что хромогликат подавляет выделе-				рушая транспортную функцию этого белка в
ние гистамина посредством механизма, вклю-				отношении кальция.
чающего взаимодействие препарата и ионов				Дополнительные подтверждения гипотезы о
кальция с мембранным белком. Для изучения				роли белка, связывающего хромогликат, по-
связывания хромогликата с			базофильными	лучены при слиянии очищенного хромогликат-
лейкозными клетками крыс (RBL-2H3) препарат				связывающего белка, заключенного в оболочку
добавляли в нерастворимые матриксы бус.				вируса Сендай, с вариантом клеток RBL-2НЗ,
Связывание препарата специфично в отношении				неспособных секретировать гистамин в ответ
клеток RBL-2H3 и не определяется у клеток				на стимуляцию реакцией антиген-IgE. Такое
мастоцитомы Р-815, не секретирующей				слияние с включением белка в дефектные
гистамин, а также у тимоцитов. Удаление				клетки превращает их из нереактивных в отве-
трипсином мембранного белка отменяет свя-				чающие на стимуляцию антигенIgE. Кроме
зывание хромогликата с клетками RBL, как и				секреции гистамина в ответ на антигенную
связывание кальция с помощью EDTA. Сле-				стимуляцию, вариантные клетки становятся
довательно, хромогликат взаимодействует с				способными к захвату 45Са. Захват кальция и
мембранным белком на клетках RBL, для чего				секреция гистамина в ответ на стимуляцию
требуются ионы кальция. Связывание клеток и				антигенIgE пропорциональны количеству
хромогликата, конъюгированного с бусами,				хромогликатсвязывающего белка, внесенного в
предупреждается		свободным	хромогликатом,	клетку, причем насыщение ответа достигается
тогда как хромогликат, конъюгированный с				на уровне, соответствующем содержанию белка
бусами, подавляет выделение гистамина из				в нормальных отвечающих клетках RBL.
клеток в ответ на стимуляцию антиген-IgE.				Анализ полученных данных свидетельствует

Данные наблюдения свидетельствуют о на-		о том, что белок, связывающий хромогликат,
личии мембранного белкового рецептора для		является белком, переносящим кальций,
хромогликата. Были предприняты попытки		который необходим для секреции гистамина
изолировать рецептор с помощью двух само-		клетками RBL, стимулированными взаимодей-
стоятельных подходов, один из которых вклю-		ствием антигенIgE. Экспериментально вы-
чает в себя аффинную хроматографию, а дру-		полнен следующий этап исследования: включе-
гой-иммунопреципитацию мембранного белка.		ние белка, связывающего хромогликат, в ли-
В результате исследований получен белок с		пидный бислой индуцирует проводимость би-
молекулярной массой 60 000, который специ-		слоя при его обработке антителами к белку.
фичен для клеток RBL-2H3 и не выявляется на		Антиген или анти-IgE подобным действием не
клетках мастоцитомы Р-815 и тимоцитах. Сво-		обладает. Проводимость бислоя возникает при
бодный хромогликат и EDTA предупреждают		наличии Fc-рецептора и(или) одного связыва-
иммунопреципитацию белка	антителами к	ющего белка, но в отсутствие антигена. Прово-
хромогликату. В ряде очень изящных экспери-		димость каналов, образуемых в двойном слое в
ментов продемонстрирована	функциональная	результате перекрестного связывания Fc-pe-
значимость полученного белка. Некоторые ва-		цепторов для IgE в присутствии хромогликат-
рианты клеток линии RBL-2H3 несут IgE-pe-		связывающего белка, составляет примерно 2pS,
цепторы, но не выделяют гистамин в ответ на		но «время открытия» слишком вариабельно для
стимуляцию антиген-IgE. Эти варианты клеток		точного определения.
секретируют гистамин при действии ионо-фора		Эти очень изящные эксперименты направ-
А23187, что указывает на сохранность		лены на определение наличия в мембранах
секреторного механизма, который активируется		клеток RBL белка, способного к формированию
повышением концентрации внутриклеточно-		каналов. Более специфично белок взаимо-