Руководство по иммунофармакологии / 013306

142 Глава 13

дотелиальные клетки кроликов также обладают ферментом, активирующим фактор Хаге-мана.

Кининазы

КининазаII (ангиотензинконвертирующий

фермент)

Этот металлофермент, содержащий цинк, является пептидилдипептидазой с молекулярной массой примерно 150000, который отщепляет две С-концевые аминокислоты (фен-арг) от

брадикининов, таким образом инактивируя их. Активный фермент локализуется на люминальной поверхности эндотелиальных клеток. Примерно половина кининазы II организма находится в легких, которые в связи с этим являются главным местом метаболизма кининов. Данный фермент также отщепляет две С- терминальные аминокислоты от ангиотен-зина I, превращая его в ангиотензин II, мощный сосудосуживающий пептид. Аффинитет кининов к ферменту в 100 раз выше, чем у ангиотензина I (Km-10-7 и 10-5 соответственно). Следовательно, брадикинин может

Рис. 62. Молекулярная модель контактной активации системы фактора Хагемана. Показаны два (А и Б) альтернативных пути. Отрицательно заряженные поверхности изображены в нижней части каждой диаграммы. Для обозначения молекул используются следующие сокращения: фХ-фактор Хагемана; фХа-активированный фактор Хагемана; ПК-прекалликреин; К- калликреин; Х1-фактор XI системы коагуляции; Х1а-активированный фактор XI; ВМ Кгн-высокомолекулярный кининоген.

Схема А. верх: фХ связывается с отрицательно заряженной поверхностью. Комплекс ПК и ВМ Кгн в растворе представляет отрицательно заряженную поверхность. фХ на поверхности чувствителен к ферментативному расщеплению и активации (отмечено зигзагообразной стрелкой). В расщеплении фХ в плазме наиболее часто участвует калликреин, показанный здесь как расщепляющий фермент; однако возможно вовлечение и других ферментов. Хотя это никак не обозначено, калликреин действует значительно активнее, когда ВМ Кгн связан непосредственно с фХ. Средняя и нижняя диаграммы: фХ активирует ПК с образованием К. Нижняя диаграмма: фХ расщепляется в месте 2 с образованием р-фХа (активный фрагмент с м. м. = 28000). который выделяется в супернатант. В альтернативном представленному на схеме А случае фХ расщепляется только в месте 1 (т.е. в пределах дисульфидной петли) и затем в виде а-фХа остается присоединенным к поверхности. Схема Б: фХ присоединяется к поверхности и активируется ферментом, чаще всего калликреином. ВМ Кгн и ПК присоединяются к его связям к поверхности. На средней и нижней диаграммах фХа в форме а- фХа, расщепленного в месте 1, затем расщепляет и активирует фактор XI системы коагуляции, который присоединяется к поверхности рядом с фХ с помощью ВМ Кгн. а-фХа и Х1а в основном остаются связанными с поверхностью [Cochrane, Griffin.- Amer. J. Med., 1979, 67, 657].

Рис. 63. Возможные пути активации системы фактора Хагемана.

и косвенно влиять на сосудистый тонус, успешно конкурируя с ангиотензином I за фермент кининазу II. Ингибиторы кининазы I, производные пептидов из змеиного яда (например, SQ 20881) оказались чрезвычайно полезными при определении значимости инактивации брадикинина и образования ангиотензина И в различных условиях, например, при разных типах шока и при регуляции артериального давления.

Карбоксипептидаза N (кининаза I, карбоксипептидазаВ, инактиватор анафилатоксина)

Металлофермент, содержащий цинк, с молекулярной массой около 300000, присутствует в плазме в концентрации 30-40 мкг/мл. Он отщепляет С-концевые основные аминокислоты у некоторых биологически активных пепти- дов-брадикинина, лиз-брадикинина, фибринопептидов, СЗа, С4а и С5а. Вероятно, карбоксипептидаза N является главным инактиватором СЗа, С4а и С5а в плазме, но кинины инактивируются ею значительно медленнее.

Другие клеточные пептидазы также могут инактивировать брадикинин или ангиотензин; их значимость еще предстоит определить.

Фармакологические эффекты кининов

Кинины могут давать расслабление или сокращение гладких мышц различных органов, увеличивать проницаемость сосудов и вызывать боль. Кроме того, кинины обладают рядом других эффектов (см. Fujii et al., 1979): например, они стимулируют пролиферацию различных типов клеток in vivo и in vitro,

включая тимоциты. Они оказывают как прямое действие, так и непрямое влияние через метаболиты арахидоновой кислоты, гистамин, серотонин, вазопрессин и катехоламины. Однако до настоящего времени не существует общепринятых взглядов на их роль в физиологии и в воспалении. В значительной мере это обусловлено неудачными попытками создания специфических ингибиторов калликреинов и аналогов брадикининов, которые позволили бы оценить вклад кининов в биологические процессы.

Рецепторы для кининов идентифицированы на различных клетках, они достаточно специфичны и обладают высокой константой диссоциации (10-9 М). Эти рецепторы модулируются стероидными гормонами. Механизм влияния кининов на клеточные функции пока неясен. Однако вследствие взаимодействия с клетками (предположительно через специфические рецепторы) брадикинин стимулирует метаболизм фосфатидилинозитола, а также арахидоновый обмен и метаболизм циклических нуклеотидов. В вызываемых брадикини-ном изменениях в клетке принимает участие кальций, однако механизмы внутриклеточной передачи сигнала еще не определены.

Действие кининов на кровеносные сосуды осуществляется, по крайней мере частично, через метаболизм арахидоновой кислоты. Так, взаимодействие кининов с рецепторами клеточной поверхности приводит к активации ацилгидролаз (например, фосфолипазы А2), которые высвобождают арахидоновую кислоту из фосфолипидов. По-видимому, кинины влияют и на другие этапы метаболического пути арахидоновой кислоты, так как они избирательно увеличивают образование ПГЕ (ва-

144	Глава 13
зодилататор) в артериях и ПГF (вазоконстрик-		действие. Кинины влияют также на метабо лизм
тор)	в венах. Такое различие обусловлено,	мышц, репродуктивные органы, функция

вероятно, активацией ПГЕ 9-кеторедуктазы желудочно-кишечного тракта и центральную

	кининами в венах. Возможно, что внутрисосу-				нервную систему.
	дистые кинины не достигают гладкомышечных
	клеток, поскольку эндотелиальные клетки об-				Брадикинин при воспалении и патологии
	разуют относительно непроницаемый слой с				Хотя кинины способны вызывать классические
	высокой кининазной активностью. В то же
	время между эндотелиальными и подлежащими				признаки воспаления (отек, покраснение, жар и
	гладкомышечными		клетками	существуют	боль), технически невозможно прямо дока-зать,
	тесные контакты. Так, кинины могут вызывать				что они являются важными медиаторами
	сокращение или расслабление мышц посред-				воспаления. Отсутствие необходимой инфор-
	ством внутриклеточных сигналов, например				мации в значительной мере обусловлено следу|
	простагландинов. Эти передатчики действуют на				ющим: а) отсутствием специфических антаго-
	протеинкиназы, зависимые от циклических				нистов кининов или ингибиторов ферментом
	нуклеотидов, которые регулируют взаимодей-				генерирующих кинины, хотя в настоящее время
	ствие актин-миозин-АТФ под влиянием				описаны предполагаемые антагонисты; б) не
	кальмодулина.				возможностью изменения скорости и ампли
	Влияние кининов на сосудистую проницае-				туды активации и инактивации кининов в об-
	мость осуществляется на уровне посткапил-				ласти воспаления; в) вовлечением в большин-
	лярных венул, что было установлено при				ство воспалительных явлений многих медиа-
	электронной микроскопии и			радиоизотопных	торных систем (например, кинины, метаболия
	исследованиях. Увеличение проницаемости мо-				ты арахидоновой кислоты, гистамин, серото-
	жет быть связано с сокращением эндотелиаль-				нин, ангиотензин, СЗа, С4а, С5а, свободные
	ных клеток и расширением межклеточных				радикалы кислорода,	продукты	расщепления
	сочленений и предупреждается агонистами (3-				фибрина, протеолитические ферменты и др.).
	адренорецепторов. Этот процесс требует				Тем не менее существуют методы, позво-
	определенной энергии и, по-видимому, опо-				ляющие оценить состояние кинингенерирую-
	средуется простагландинами.				щих систем, например системы фактор Хаге-
	Другие медиаторы (такие, как гистамин),				манапрекалликреинвысокомолекулярный
	участвующие в воспалительном процессе, могут				кининоген. Несмотря на относительную гру-
	сильно изменить нормальную реакцию клеток				бость этих методов, они дают возможность
	на брадикинин. Поэтому эффекты бра-дикинина				определить генерирование кининов при ряде
	при	воспалении	нельзя	рассматривать	состояний.
	изолированно: здесь следует учитывать				Наследственный ангионевротиче-ский отек-
	сложную сеть взаимодействующих медиаторов.				это врожденное	доминантное	аутосомное
					заболевание, проявляющееся по-вторными
	Физиологические эффекты кининов				эпизодами отека и обусловленное отсутствием
					(или наличием дефектного) ингибитора С1.
	Роль калликреин-кининовой системы в органах				Ингибитор С1 является главным ингибитором
	и в целостном организме животных изучена				активированного	фактора	Хаге-мана,
	недостаточно и представлена			совокупностью	калликреина плазмы, а также Cls и С1г системы
	многих различных эффектов. Например, бра-				комплемента. Во время эпизодов отека
	дикинин в сердечно-сосудистой системе оказы-				обнаруживается активация системы комп-
	вает прямое действие на сердечную мышцу,				лемента и системы фактора Хагемана. Недавние
	вызывает расширение артерий и сужение вен,				исследования показали, что независимо от
	увеличивает число функционирующих капил-				вклада какой-либо из этих систем (или обеих) в
	ляров и повышает проницаемость сосудов.				формирование отека особо важную роль в
	Кроме того, брадикинин оказывает непрямое				развитии данного состояния играет контактная
	влияние через выделение катехоламинов и через				система (фактор Хагемана).
	нервные рефлексы, регулирующие частоту				Подаграэто острый воспалительный
	сердечных сокращений и сосудистый тонус.				артрит, вызываемый известным специфическим
	Ранее отмечались подобные эффекты брадики-				агентом-кристаллами уратов натрия. Кристаллы
	нина	в легких, включая бронхосуживающее			уратов натрия служат поверхностью для
					активации системы фактора Хагема-

								Кинины	145
на. По имеющимся данным, фактор Хагемана			мирование		происходит		преимущественно		в
активируется при подагре, а в воспаленном			брюшной полости, что приводит к накоплению
суставе определяется высокий уровень кини-			перитонеальной жидкости и вызывает сильные
нов. Вместе с тем известно, что кристаллы			боли.
уратов натрия активируют комплемент, тром-			Активация in vitro системы фактора Хаге-
боциты и нейтрофилы. Действительно, воспа-			мана с последующим генерированием кининов,
ление, вызванное введением уратов натрия в			как и их внутрикожное введение, вызывают
суставы собак, может быть устранено удале-			воспаление. Всего лишь 2,5 нг активированного
нием нейтрофилов. Таким образом, роль раз-			фактора	Хагемана повышает				проницаемость
личных механизмов в активации системы фак-			сосудов. Такое количество фактора Хагемана
тора Хагемана остается неясной.			составляет 0,01% его содержания в 1 мл плазмы.
Гипотензию и внутрисосудистую коагуля-			Установлено, что система фактора Хагемана
цию при септическом шоке и сыпном тифе			является медиатором многих других состояний,
связывают с активацией фактора Хагемана. Ряд			включая аллергические реакции, карциноидный
данных свидетельствует в пользу активации			синдром, демпинг-синдром после гастрэктомии,
системы фактора Хагемана у человека и			заболевания			коронарных		артерий,
экспериментальных животных при данных			внутрисосудистую коагуляцию,					нефротический
состояниях, что предполагает генерирование			синдром и мигрень. Однако определить
активных компонентов и кининов. Однако			конкретный вклад образования кининов в
вклад выделившихся кининов в развитие дан-			общую воспалительную реакцию удается не
ного синдрома неясен. Активированный фактор			всегда,	что		связано	с	отсутствием
Хагемана способен вызывать гипотензию, что			специфических антагонистов.
четко установлено у людей: при введении			Наконец, не следует забывать, что отсут-
концентратов альбумина, загрязненных акти-			ствие в циркуляции определяемых количеств
вированным фактором Хагемана, наблюдается			высоко-	и	низкомолекулярных кининогенов
резкое снижение артериального давления.			(аутосомно-рецессивное наследование) может
Недавно из жидкости, полученной при			не иметь клинических проявлений. Хотя таких
бронхиальном лаваже у больных бронхиальной			людей выявлено очень мало, у них нет явной
астмой, вместе с лиз-брадикинином был			тенденции к инфекциям или каким-либо симп-
выделен уникальный калликреин тканевого ти-			томам дефицита воспалительных реакций. Более
па. Постоянное образование кинина при забо-			того, лица с дефицитом фактора Хагемана или
леваниях бронхов может играть первостепен-			калликреина не страдают от кровотечений и не
ную роль в возникновении бронхоспазма и, как			имеют других явных признаков дефицита
правило, ведет к увеличению продукции мета-			защитных механизмов. В то же время следует
болитов арахидоната и важных бронхокон-			помнить, что первые описанные больные с
стрикторных лейкотриенов. Изучение аллерги-			дефицитом С2 были клинически здоровыми,
ческого ринита показало, что в его развитии			хотя в настоящее время известно, что 50% таких
принимают участие лиз-брадикинин и бради-			больных			страдают	аутоиммунными
кинин. После предъявления аллергена в на-			заболеваниями.
чальном лаваже обнаруживаются кинины и
калликреины, а также плазменные и тканевые			Кининынемлекопитающих
кининогены, присутствующие во время аллер-
гических симптомов.			В отличие от млекопитающих, у которых ки-
Одним из главных симптомов острого пан-
креатита является выраженная гипотензия. Она			нингенерирующие системы циркулируют в не-
вызывается	сочетанием	гиповолемии и	активной форме и активируются локально, в
выделения в циркуляцию гипотензивных ве-			ядовитом мешочке ос и шершней присутствуют
ществ. Два панкреатических фермента-трипсин			активные кинины. Кожа амфибий также
и калликреинспособны высвобождать ки-нин			чрезвычайно богата активными брадики-нинами.
из кининогена; активный калликреин под-			Неизвестно, правда, насколько важны такие
желудочной железы идентифицирован в крови			кинины, служат ли они для защиты организма,
больных острым панкреатитом. Как показы-			для транспорта или других целей.
вают клинические исследования и экспери-			Кинины немлекопитающих обладают час-
менты на собаках, данный кинин образуется			тичной гомологией с брадикинином.
при остром	панкреатите,	причем его фор-

146	Глава 13
Лейкокинин		в действии других гормонов. Рецепторы к БК не
Лейкокинины представляют собой кислые ги-		выделены и не охарактеризованы биохими-
		чески.
потензивные полипептиды, содержащие 21-25		Предполагается существование более одно-
аминокислот, которые вызывают сокращение		го типа БК-рецепторов; некоторые авторы
или расслабление гладких мышц in vitro, a также		предполагают	разделить		их	на	подтипы В1 и
повышение сосудистой проницаемости. Они		В2. Выделение подтипа В1 основывается на
образуются из лейкотриенов клеточной кислой		данных о том, что дез-арг9-БК, неактивный во
протеиназой, которая почти определенно		многих тест-системах,			значительно			активнее
является лизосомным ферментом катепси-ном		БК в некоторых тканях (в аорте и мезентери-
D. Субстрат, лейкокиноген (молекулярная масса		альных сосудах кроликов). Более того, лей8, дез-
41 000), обнаруживается в асцитной жидкости и		арг9-БК обладает		конкурентным антагонизмом
не определяется в нормальной плазме, где он		по отношению к БК и дез-арг9-БК в тех же
может образовываться при прогревании в		тканях, хотя в других тканях подобный
течение 30 мин при 57 °С. Предположение об		антагонизм	не	наблюдается.			Одной из
участии лейкокинина было выдвинуто при ис-		особенностей реакций, опосредованных В1-ре-
следовании асцитной жидкости мышей-опухо-		цепторами, является то, что они не наблю-
леносителей, у которых введение пепстатина		даются сразу же после приготовления изоли-
(ингибитора катепсина D) подавляет увеличение		рованных препаратов in vitro, а усиливаются
асцита.		постепенно в течение нескольких часов в ре-
		зультате процесса, определенно зависящего от
Заключение		синтеза белка [Bonthillier et al., 1987]. Посколь-
Вполне вероятно, что брадикинины участвуют в		ку известно,	что	БК	in	vivo	превращается
		в дез-арг9-БК, BI-рецепторы могут иметь не-
воспалительных реакциях, особенно в фор-		которое физиологическое значение. Предпола-
мировании отека и боли. Однако степень их		гается, что тканевая травма обусловливает по-
вклада еще предстоит определить.		степенное появление образующихся В1-рецеп-
		торов, но имеющиеся сегодня доказательства
		достаточно скудны и значимость данных ре-
		цепторов остается предметом гипотез.
		Постулировано, что В2-рецептор-это общее
		понятие, используемое при описании лю-бой
		реакции на БК, которая не вызывается дез-арг9-
		БК или блокируется лей8,дез-арг9-БК. Эти
		реакции входят в весьма широкий спектр
		эффектов, вызывающих расширение или суже-
		ние многих кровеносных сосудов, сокращение
		гладких мышц внутренних органов, повышение
		сосудистой проницаемости, увеличение се-
		креции желудочно-кишечного и дыхательного
		эпителия, стимуляцию ноцицептивных аффе-
		рентных нейронов, митогенез и др. Как было
II. Кининовые рецепторы		показано, эти реакции возникают в результате
		активации различных передающих систем в
и сопряжение рецептор-эффектор		разных тканях, поэтому нет оснований пред-
		полагать, что во всех случаях участвует один и
X. П. РАНГ (Н.Р. RANG)		тот же тип БК-рецепторов. Действительно,
Имеются веские доказательства (основанные на		недавние исследования с использованием анта-
		гонистов (см. ниже) подтвердили возможность
фармакологических исследованиях и опре-		существования нескольких				разных		подтипов
делении связывания) того, что брадикинин свя-		В2-рецепторов.
зывается со специфическими мембранными ре-		Показано, что у многих типов клеток бра-
цепторами и оказывает влияние на клеточном		дикинин активирует фосфолипазу С, что при-
уровне через одну или несколько биохимиче-		водит к образованию инозитолфосфатов и диа-
ских передающих систем, которые подобны или		цилглицерола из мембранных фосфолипидов.
даже идентичны системам, участвующим

	Кинины	147
(Детальное описание механизма передачи при-	ничная модификация превращает БК в частич-
ведено в главах 2, 3 и 4.) Эти вторичные	ный агонист, эффективность которого зависит
передатчики вызывают соответственно выде-	от используемой тест-системы. Последующие
ление кальция и активацию протеинкиназы С,	модификации, показанные в табл. 14, приводят к
а многие эффекты БК, например сокращение	образованию чистых антагонистов, наиболее
гладких мышц, вероятно, являются результа-	сильные из которых имеют рА2 порядка 6-7.
том данного процеса. Кроме того, БК во	Фармакологические исследования этих антаго-
многих тканях вызывает активацию фосфоли-	нистов показали, что они блокируют все эф-
пазы А2, что приводит к образованию арахи-	фекты БК без определенного уменьшения реак-
доновой кислоты и различных эйкозаноидов	ций на другие пептиды, например на ангио-
(см. главу 10). Многие эффекты БК ослабля-	тензин или вещество Р. Блокируются как В2-,
ются препаратами, подавляющими метабо-	так и В1-рецепторы. Исследования данных ан-
лизм арахидоновой кислоты (см. главы 24 и	тагонистов в кровеносных сосудах и препаратах
25), поэтому предполагается, что двойствен-	гладких мышц внутренних органов обнаружили
ность действия БК при активации этих двух	определенные качественные различия, что,
жпаз (возможно, опосредуемой одним или	возможно, свидетельствует о некоторой
несколькими G-белками) необходима для мно-	гетерогенности БК-рецепторов, опосредующих
гих его эффектов. Дополнительным механиз-	разные реакции; однако для получения ясного
мом, весьма важным для расширения некото-	представления о них необходимы дальнейшие
рых (не всех!) сосудов, является выделение	исследования. Следует помнить о чувствитель-
РФЭ (см. главу 8). Являются ли рецепторы,	ности агонистов и антагонистов БК к инакти-
связанные с различными системами вторичных	вации тканевыми пептидазами, что может
мессенджеров, фармакологически различимы-	осложнить определение антагонизма обычными
ми, пока неясно.	фармакологическими методами. Предпола-
Интерес к БК-рецепторам в последнее вре-	гается, что антагонисты БК должны иметь
мя еще более возрос в связи с получением ряда	значительную клиническую ценность, посколь-
селективных конкурентных антагонистов, бло-	ку БК является медиатором ряда реакций при
кирующих многие эффекты, опосредованные	воспалении (особенно возникновения боли, по-
В2-рецепторами. Эти соединения были откры-	вышения сосудистой проницаемости и увели-
ты Stewart и соавт. при многостороннем иссле-	чения эпителиальной секреции), а также при
довании эффектов различных аминокислотных	карциноидном синдроме и демпинг-синдроме.
заместителей в отношении активности анало-	Соединения данного типа, представленные в
гов БК. Модификацией молекулы БК, необхо-	табл. 14, не имеют клинической значимости,
димой для получения антагонистов, является	поскольку их пептидная структура предполагает
замещение про7-ароматической D-аминоки-	быструю деградацию под действием пеп-тидаз
слотой, например D-фен (табл. 14). Эта еди-	плазменных и тканевых пептидаз и, сле-

Таблица 14. Пептидная структура ряда соединений

БК-брадикинин; тиэ-тиэнилаланин; гип-гидроксипролин.

148 Глава 13

довательно, кратковременность действия. Тем не менее они служат ценным экспериментальным инструментом, который позволяет четко определить роль (или ее отсутствие) БК при различных патологических состояниях.

14 Лимфокины

Дж. Морлей, Дж. М. Хансон, В. М. Румьянек (J. Morley, J. M. Hanson, V. М. Rumjanek)

Иммунная система регулируется сложной сетью клеточных и гуморальных взаимодействий. Неантительные продукты лимфоцитов (лимфокины) и макрофагов (монокины) участвуют во всех фазах иммунного ответа. Лимфокины и монокины являются белками или гликопротеинами, образуемыми лимфоцитами и макрофагами в культуре в ответ на антигенную или митогенную стимуляцию. Они идентифицируются по клеточному происхождению и эффектам, вызываемым в клетках-мишенях. Лимфокины и монокины сами не содержат антигенов или их фрагментов, что отличает их от антител. Термины «лимфокины» и «монокины» не распространяются на низкомолекулярные вещества, выделяемые лимфоцитами и макрофагами при активации (например, простаноиды и нуклеотиды).

Историческая справка

Концепция гиперсенситивности замедленного типа была неопределенной в течение длительного времени, до 1942 г., когда Landsteiner и Chase в классических экспериментах с клеточным переносом показали, что данный процесс связан с лимфоцитами. Гистопатология кожных реакций повышенной чувствительности замедленного типа характеризуется периваскулярным скоплением мононуклеарных клеток вокруг капилляров и небольших венул (особенно в поверхностной дерме), а также нейтрофилов, эозинофилов и базофилов. Эти признаки отличают реакции повышенной чувствительности замедленного типа от ответов на неспецифические повреждения тканей. Ранее предполагалось, что антиген цитотоксичен для сенсибилизированных мононуклеарных клеток при замедленной гиперсенситивности [Rich, Lewis, 1932]. Первое предположение об участии сенсибилизированных лимфоцитов в реакциях повышенной чувствительности замедленного типа было сделано Marks и James в 1953 г. По аналогии с выделением гистамина из тучных клеток после антигенной стимуляции при ана-

II 1134

филаксии, они предположили, что преформированный медиатор выделяется из лимфоцитов при реакциях повышенной чувствительности замедленного типа. Были предприняты попытки охарактеризовать и последовательно очистить биологически активный материал из разрушенных лимфоцитов, причем особое внимание уделялось кожным реакциям, вызываемым этим материалом, названным фактором проницаемости лимфатических узлов (ФПЛУ). Препараты ФПЛУ были ограничены по спектру биологической активности, и изменения сосудистой проницаемости, видимо, были связаны с основными белками, присутствующими в этом материале.

В то же время внимание ряда иммунологов было направлено на проявления in vitro клеточного иммунитета. Хорошо установлено, что селезеночные эксплантаты представляют in vitro модель клеточного иммунитета, так как миграция клеток из селезеночного эксплантата подавляется антигенами, вызывающими замедленную гиперсенситивность у животныхдоноров. Ввиду трудоемкости и сложности этой методики George и Vaughan предложили капиллярный метод изучения in vitro миграции популяций воспалительных клеток, полученных из перитонеальнои полости. Как и при использовании метода селезеночных эксплантатов, миграция клеток селективно подавляется антигеном, когда донор клеток проявляет замедленную гиперсенситивность к тому же антигену. Метод капиллярных трубочек позволяет смешивать различные клеточные популяции, поэтому в 1964 г. David и соавт. смогли установить, что для получения реакции требуется лишь небольшой процент клеток от сенсибилизированного донора. Это наблюдение вместе с феноменом подавления антигениндуцированного торможения клеточной миграции ингибиторами белкового синтеза послужило отправной точкой для предположения о существовании медиатора, обеспечивающего усиление ответа на антиген. В 1966 г. David показал, что антигенная стимуляция вызывает выделение в культуральную среду вещества,

149

150 Глава 14

Рис. 64. Концепция лимфокинов: лимфокины представляются такими же иммунологически неспецифическими медиаторами гиперсенситивности IV типа, как и гистамин при гиперсенситивности I типа.

тормозящего миграцию как сенсибилизиро-		Образование лимфокинов
ванных, так и несенсибилизированных клеточ-		Лимфокины образуются в процессе активации
ных популяций. Bloom и Bennet обнаружили,
что макрофаги, преобладающие среди мигри-		лимфоцитов. Активация лимфоцитов может
рующих клеток, вызывают торможение мигра-		быть достигнута специфическим антигеном
ции. Поскольку на сенсибилизированные лим-		или (гораздо чаще) неспецифическим (поликло-
фоциты, присутствующие вместе с антигеном,		нальным) стимулом, например митогеном
приходилась ничтожная часть (<1%), было		конканавалином А. Возможно, что и другие
сделано предположение, что влияние антиген-		неспецифические стимулы активации лимфоци-
сенсибилизированных клеток	на макрофаги	тов вызывают образование лимфокинов. Лим-
осуществляется через неспецифический фактор.		фоидные клетки получают из различных источ-
Таким образом, концепция лимфокинов разви-		ников, включая селезенку, лимфатические узлы
валась аналогично концепции	дегрануляции	и воспалительные экссудаты, а также перифе-
тучных клеток, за исключением того, что ме-		рическую кровь или грудной проток. Кроме
диаторы клеточного иммунитета находятся не в		того, лимфокиноподобная активность может
преформированном виде, а образуются через		генерироваться спонтанно лимфоидными кле-
несколько часов и обладают более длительными		точными линиями в культуре. Такие лимфоид-
эффектами (рис. 64).		ные клетки, задержанные в G1-фазе клеточного

цикла, продуцируют большее количество лимфокинов, чем клетки, приступившие к митозу. Это совпадает с наблюдением более выраженного синтеза специфического белка (меланин, коллаген, миозин и др.) в неделящихся клетках по сравнению с делящимися. Для получения лимфокинов обычно культивируют примерно 1 млн клеток в 1 мл в течение ночи в присутствии индуцирующего стимула. Выход биологически активного материала чаще всего очень низок, так что в процессе работы приходится заготавливать удачные партии материала для серийных исследований.

Следует отметить, что тщательно контролируемые условия культивирования не обязательно приводят к образованию сравнимых препаратов лимфокинов. Таким образом, относительная активность, а также соотношение различных форм активности в удачных препаратах могут варьироваться в широких пределах.

Методы, используемые для отделения индуцирующего антигена от лимфокинов, зависят от применяемого антигена. При использовании бычьего у-глобулина в качестве антигена добавление в супернатанты культур кристаллического сульфата аммония для получения 40% конечной концентрации приводит к отделению лимфокина от антигена с небольшой потерей биологической активности. Напротив, при колоночной хроматографии и подобных ей методах потеря общей биологической активности бывает значительной. Препараты лимфокинов, полученные посредством лиофилизации, относительно стабильны, однако получаемые таким способом стандартные препараты пока недоступны. Для получения белковых компонентов ряда лимфокинов и монокинов используются скорее методы генной инженерии с клонированием кДНК и ее экспрессией в бактериях. Такие белки обладают биологической активностью, но отличаются от лимфокинов, образуемых активированными клетками, отсутствием в них Сахаров, обычно добавляемых при гликозилировании. Цитокины, полученные таким методом, используются в клинике.

Проявление биологическойактивности на разных клетках-мишенях

Обычно биологическая активность лимфокинов описывается (по возможности) в контексте с их клетками-мишенями.

Лимфокины 151

Рис. 65. Кривая доза-эффект стимуляции синтеза ДНК лимфоцитов in vitro стандартным препаратом лимфокина. Синтез ДНК определяется здесь по захвату 3Н-тимидина (распады в минуту, среднее значение и стандартное отклонение) [Bray и соавт.- Clin. Exp. Immunol., 1976, 23, 333].

Лимфоциты

Первоначальное описание митогенного действия лимфоцитов было дано Kasakura и Lowenstein (1965), отметившими появление митогенного материала в смешанной культуре лимфоцитов, a Dumonde и соавт. в 1968 г. впервые назвали эту наблюдавшуюся активность «лимфокином». Данная стимулирующая активность определялась путем подсчета митозов или по включениям тимидина, меченного тритием, как индекс синтеза ДНК (рис. 65). Активация лимфоцитов может наблюдаться и без их клеточного деления. В этом случае увеличенный