medvir_xxvii_2_2013

40	Медицинскаявирусология.томXXVII(2)

птомах данной инфекции. После обращения в лечебное учреждение значительных задержек с госпитализацией в стационар не было. В то же время при первичном обращении диагноз ГЛПС выставлентолькоунезначительногоколичествабольных, и большинство пациентов было госпитализировано (нередко не в инфекционные больницы) с различными диагнозами. Установление окончательного диагноза ГЛПС оказывалось возможным лишь после проведения специфической серодиагностики, то есть после получения положительных результатовисследованиясывороткикровинаприсутствие антител к хантавирусу-возбудителю ГЛПС.

Перечень первичных клинических диагнозов у больных с установленным серологическим диагнозом ГЛПС отличался разнообразием нозологических форм: 32% составляли нефрологические заболевания (острый и хронический пиелонефриты, гломерулонефрит,почечнаяколика,токсическаянефропатия); 23%– респираторныезаболевания(ОРЗ,ОРВИ,грипп, пневмония,бронхит,ларингит);7%–заболевания,ас- социированныесабдоминальнойпатологией(холецистит,панкреатит,ОКИ,энтероколит,острыйгастроэнтерит, язва 12-ти перстной кишки); 1% – гинекологическиезаболевания(кровотечение),лихорадканеясного генеза – 8%. Удельный вес прочих диагнозов (менингит, артрит, ишемическая болезнь, токсическое действиенеизвестногосвойства)составлял8%.

Существенных различий клинических форм течения болезни у больных ГЛПС, этиологически обусловленной вирусами Пуумала и Добрава, не выявлено.

Заключение

Вспышка ГЛПС в Тамбовской области длилась 13 недель с конца ноября 2006 г. по апрель 2007 г., официально зарегистрирован 91 случай. Более 90% больных ГЛПС было инфицировано вирусом Добрава. Заражение людей этим вирусом происходило, преимущественно, во время сельскохозяйственныхработналичныхподворьяхивпроизводственных условиях, связанных с уходом за домашним скотом. В последующие годы регистрировалась спорадическая заболеваемость ГЛПС, в основном,ассоциированнаясвирусомПуумала.Заражение происходило при посещении леса, на рыбалке, на охоте. В конце 2011 г. произошло повышение заболеваемости ГЛПС. Установлены выраженные различия эпидемического процесса при ГЛПС, вызванной вирусами Добрава и Пуумала.

fewpatientswerediagnosedwithHFRSduringthefirst visit,butthemajorityofpatientswashospitalizedwith various diagnoses (and often in other that infectious diseaseshospitals).ThefinalHFRSdiagnosiswasmade onlyafterspecificserodiagnosisrevealedthepresence of antibodies to hantavirus, causative HFRS agent, in patient’s serum.

The primary clinical diagnoses in patients with serologicallydocumentedHFRS included thefollowing nosological entities: nephrological diseases, including acute and chronic pyelonephritis, glomerulonephritis, renal colic, and toxic nephropathy (32%), respiratory diseases, including acute respiratory disease, acute respiratory viral infection, fly, pneumonia, bronchitis, andlaryngitis(23%),diseasesassociatedwithabdominal pathology, including cholecystitis, pancreatitis, acute intestinalinfection,enterocolitis,acutegastroenteritis, and duodenal ulcer (7%), gynecological diseases and hemorrhages (1%), and fever of unknown etiology (8%). Other diagnoses (meningitis, arthritis, ischemic disease, and intoxications with unknown agents) constituted less than 8%.

No significant differences in the clinical course of HFRS caused by Puumala and Dobrava viruses were revealed.

Conclusion

The HFRS outbreak in the Tambov region lasted 13 weeks from the end of October 2006 to April 2007. During the next 3 years (2008-2010) after this winter outbreakin2006-2007,onlysporadicHFRScaseswere recorded. From 2 to 10 HFRS cases were recorded yearly during the summer-autumn season, all cases were caused by Puumala virus. The incidence of HFRS infection increased again in late 2011. During HFRS outbreak, humans were infected with Dobrava virus primarily during agricultural works related to livestock careinprivatefarmsandlivestockenterprises.In93.4% cases, HFRS was caused by Dobrava virus. Sporadic cases of HFRS infection were detected throughout the surveillance period and were primarily associated with Puumala virus. The patients were infected during forest trips, fishing, and hunting. Essential differences of HFRS epidemics caused by Dobrava and Puumala viruses were revealed.

medical virology. vol. XXVII (2)

41

rEFERENCES / Литература

1.Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А., Башкирцев В.Н., Окулова Н.М., Апекина Н.С., Бернштейн А.Д., Коротина Н.А., Смирнов А.А., Юничева Ю.В., Ходякова И.А., Слюсарёва Г.П., Транквилевский Д.В., Медведкина О.А. Выделение и идентификация штаммов хантавирусов-возбудителей ГЛПС в Европейской части России // Медицинская вирусология. – 2008. – Т. XXV. – С. 142-150.

2.ТкаченкоЕ.А.,БернштейнА.Д.,ДзагуроваТ.К.,Морозов В.Г., Слонова Р.А., Иванов Л.И.,ТранквилевскийД.В.,КрюгерД. Актуальныепроблемысовременного этапа изучения геморрагической лихорадки с почечным синдромом в России // ЖМЭИ.

– 2013. – №1. – С. 51–58.

3.Транквилевский Д.В., Платунина Т.Н., Дзагурова Т.К., Бахметьева Ю.О., Коротина Н.А., Гапонов С.П., Седова Н.С., Шкиль Н.Н., Сапельников С.Ф., Марченко Н.Ф., Мамчик Н.П., Чубирко М.И., Ткаченко Е.А. Вспышка геморрагической лихорадки с почечным синдромом зимой 2006–2007 гг. в Во-

ронежской области // Медицинская вирусология.

– 2007. – Т. XXIV. – С. 145–156.

4.ХодяковаИ.А.,ЩукинаИ.А.,МурашкинаА.Н., Савельев С.И., Бернштейн А.Д., Дзагурова Т.К., Седова Н.С., Мутных Е.С. Особенности очагов ГЛПС натерритории Липецкой области // Медицинская вирусология. – 2009. – Т. XXVI. – С. 206–208.

5.Dzagurova T.K., Klempa B., Tkachenko E.A,, Slusareva G.P., Morozov V.G., Auste B., Kruger D.H. Molecular diagnostics of hemorrhagic fever with renal syndrome during a Dobrava virus outbreak in the European part of Russia // Journal of Clinical Microbiology. – 2009. – Vol. 47, №12. – P. 4029–4036.

6.Klempa B., Tkachenko E., Dzagurova T., Yunicheva Yu., Morozov V., Okulova N., Slyusareva G., Smirnov A., Kruger D. Hemorrhagic fever with renal syndrome caused by two distinct lineages of Dobrava hantavirus emerging in Russia // Emerging Infectious Diseases Journal. – 2008. – Vol.14. – №4. – P. 617–625.

42	Медицинскаявирусология.томXXVII(2)

Анализ молекулярной динамики белков Е вариантов ВКЭ на основе разности корреляционных матриц

Л. И. Козловская1*, Д. И. Осолодкин1,2, Г. Г. Карганова1

1 ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова» РАМН; 2 Химический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва

*Корреспондрующий автор: ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова»

Резюме

Белок Е вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) играет ключевую роль в начальных этапах инфекции, опосредуя взаимодействие с рецепторами клетки-мишени.Гликозаминогликаны (ГАГ)являются одним из возможных низкоаффинных рецепторов ВКЭ. Ранее было показано существование вариантов этого вируса с ГАГ-связывающим фенотипом, несущих мутации в гликопротеине Е, приводящие к повышению заряда молекулы, а также вариантов, у которых появление таковой мутации не привело к появлению данного фенотипа. В настоящей работе продолжается изучение таких вариантов методом моделирования молекулярной динамики. Был проведён анализ структурных особенностей эктодомена белка Е с заменами в позиции 67, повышающими заряд молекулы, на примере трёх вариантов ВКЭ: штамма 80к с классическим ГАГ-связывающим фенотипом и мутацией Asp67→Asn,клона18АштаммаАбсуттаровсмутацией Asp67→Gly, который не имеет ГАГ-связывающего фенотипа,ивысоковирулентногокрупнобляшечного штамма СофьинКГГ с низкой сорбцией на ГАГ,.

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, белок Е, молекулярная динамика, гликозаминогликан

Введение

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) — это переносимый клещами представитель рода Flavivirus, вызывающий тяжёлые заболевания человека c поражением центральной нервной системы.

Вирион ВКЭ имеет диаметр около 50 нм, нуклеокапсид которого состоит из молекулы РНК и корового белка С и окружён липидной мембраной, несущей 180 копий двух белков — мембранного белкаМибелкаоболочкиЕ.Поверхностьвируснойча-

Analysis of molecular dynamics of TBEV variants’ E proteins based

on difference

of correlation matrices

L.I. Kozlovskaya1*, D.I. Osolodkin1,2,

G.G. Karganova1

1 Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides

2 Department of Chemistry, Lomonosov Moscow State University, Moscow

Abstract

E protein of tick-borne encephalitis virus (TBEV) plays a key role in the early stages of the viral infection mediating the interaction with the target cell receptors. Host cell glycosaminoglycans (GAGs) are a class of putative low-affinity TBEV receptors. It has been shown previously the existence of the virus variants with GAG-binding phenotype carrying mutations in E glycoprotein leading to anincrease of the molecule charge, as well as of the virus variants, in which the appearance of such mutations has not led to the development of this phenotype. In the present work we continue the study of such variants by a molecular dynamics simulation. We analyzed structural features of E protein ectodomains with substitutions at position 67, which increase the net charge of the molecule, on three TBEV variants: strain 80k with classical GAG-binding phenotype and mutation Asp67→Asn, clone 18A of strain Absettarov with mutation Asp67→Gly, which has not GAG-binding phenotype, and highly virulent, large plaque strain SofjinKGG with low sorption on GAGs and intact Asp67.

Keywords: tick-borne encephalitis virus, E protein, molecular dynamics, glycosaminoglycan

Introduction

Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is a tick-trans- mitted virus belonging to Flavivirus genus, causing diseases leading to severe damage of central nervous system in humans.

Diameter of TBEV virion is approximately 50 nm. It contains nucleocapsid consisting of viral RNA molecule and core (C) proteins, surrounded by lipid membrane with incorporated 180 copies of two proteins – membrane (M) protein and envelope (E)

medical virology. vol. XXVII (2)

43

стицы образуют только эктодомены гликопротеина Е, а белок М скрыт под ними. Эктодомен белка Е—контактирующаясвнешнейсредойчастьмоле- кулы, в то время как контакты белка с мембраной вириона опосредованы стебелёк-якорным участком. Таким образом, гликопротеин оболочки Е отвечает за самые критические моменты жизненногоциклаВКЭ:первичноевзаимодействиесповерхностью клетки, слияние мембран вириона и клетки, освобождение вирусного генома в цитоплазму. Этот гликопротеин также является основной мишенью нейтрализующих антител иммунной системы хозяина (Lindenbach et al., 2007).

Белок Е ВКЭ состоит из 496 аминокислотных остатков. Пространственная структура была исследована методом рентгеноструктурного анализа толькодлярастворимогоэктодомена(395остатков) (Rey et al., 1995). На основе этих данных в молекуле быливыделенытридомена:I,IIиIII(Рис.1).ДоменI

— это центральный структурный домен, состоящий приблизительно из 120 остатков и включающий в себя 3 сегмента (остатки 1–51, 137–189, 285–302),

образующие 8-тяжную антипарралельную β-бочку. Две длинные вставки между этими тремя сегментами домена I представляют собой димеризационный домен II (остатки 52–136, 190–284), который вносит основной вклад во взаимодействие мономеров внутри димера белка Е. Домен II содержит пептид слияния и поэтому подвержен смещению вовремяконформационногопереходаприслиянии мембран вириона и клетки (Bressanelli et al., 2004; Stiasny et al., 2005). Домен III состоит приблизительно из 100 аминокислотных остатков (300–395) и является потенциальным сайтом взаимодействия с рецепторамиклетки.Этотдоменимеетиммуноглобулиновую укладку и соединён подвижным шарнирнымучасткомсдоменомI.

protein. The surface of the viral particle is formed by ectodomains of E protein, and M proteins are completely covered by them. E protein ectodomain (sE) is connected to the viral membrane by stemanchor region. Therefore, E protein determines the most crucial points in TBEV life cycle, such as virion attachment to the cell surface, fusion of cellular and viral membranes, and entry of the viral genome to the cytoplasm. This glycoprotein is also the main target of neutralizing antibodies of the host immune system (Lindenbach et al., 2007).

TBEV E protein consists of 496 amino acid residues. Three-dimensional structure was solved by X-ray diffraction analysis only for sE (395 residues) (Rey et al., 1995). Based on this data, sE is divided into three domains: I, II, and III (Fig. 1). Domain I is central structural domain, containing about 120 residues from three segments (residues 1–51, 137– 189, 285–302), which form 8-strand anti-parallel β-barrel. Two long linkages between domain I segments form the dimerization domain II (residues 52–136, 190–284) that plays the main role in interaction of the E protein dimer subunits. Domain II contains fusion peptide and is involved in shifting during conformational switch in the course of the fusion of viral and cellular membranes (Bressanelli et al., 2004; Stiasny et al., 2005). Domain III consists of about 100 amino acids (residues 300–395) and serves as a potential site of interaction with the receptor. This domain has immunoglobulin-like fold and is connected by a hinge to domain I.

Рис. 1. Эктодомен белка Е ВКЭ (димер) (штамм 80к). Окраска по доменам: красный домен I, жёлтый домен II, синий домен III. Домен II для одной из субъединиц показан в виде «cartoons» для обозначения элементов вторичной структуры, петля ij окрашена в зелёный цвет

Fig. 1. TBEV sE structure (dimer) (strain 80k). Domain I is colored red, domain II yellow, domain III blue. Domain II is shown in cartoon representation for one monomer to visualize secondary structure, ij loop is highlighted in green

44	Медицинскаявирусология.томXXVII(2)

Ранее было показано существование двух классоврецепторовнаповерхностиклетки,взаимодействующих с ВКЭ: высокоаффинных и низкоаффинных (Maldov et al., 1992). Различные по строению и функциям молекулы клеточной поверхности могут являться низкоаффинными центрами связывания ВКЭ.Однимизклассовтакихмолекулявляютсягликозаминогликаны (ГАГ) — линейные полисахаридные молекулы, несущие большое количество отрицательно заряженных групп. Интерес к одному из структурных классов ГАГ, гепарансульфатам, связан с тем, что эти молекулы обнаружены в организмах различных типов и почти на всех клетках млекопи-

тающих (Kim et al., 1994; Jakkola et al., 2000).

Описанные ранее лабораторные варианты флавивирусовсповышеннойаффинностьюкГАГ,включая ВКЭ, были получены в лабораторных условиях при адаптации вируса к клеткам BHK-21, SW-13, Neuro-2 или к клещам разных видов (Chiou and Chen, 2007;Eckeret al., 1999;Goto et al.,2003;Labuda et al., 1994; Lee and Lobigs, 2000, 2002; Lee et al., 2004; Lu et al., 2008; Mandl et al., 2001; Romanova et al., 2007; Ляпустин и др., 1987). Все эти ГАГ-

связывающие варианты имели замену в эктодомене поверхностного белка Е, приводящую к повышению заряда молекулы. Также все они характеризовались комплексом специфических свойств (ГАГ-связывающий фенотип), основными среди которых были мелкобляшечный фенотип в культуре клеток почки свиньи и низкая нейроинвазивность для лабораторных мышей, а также отсутствие гемагглютинирующей активности (ГА) и преципитата с антителами в ракетном иммуноэлектрофоре-

зе (РИЭФ) (Romanova et al., 2007). Это позволило полагать, что любая замена, приводящая к повышению заряда белка Е ВКЭ, приводит к появлению ГАГ-связывающего варианта.

Ранее нами был описан клон 18А штамма Абсеттаров с заменой Asp67→Gly, приводящей к повышениюзарядабелкаЕ.Однакоэтотвариантосталсявысоковирулентнымидлямышей,хотяинесколькоменее, чем родительский штамм, сохранил крупнобляшечный фенотип в культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), низкую сорбцию на модели ГАГ

— гепарин-сефарозе (ГС), ГА и способность образовывать направленный к катоду преципитат с антителами в РИЭФ (Таблица 1). В то же время штамм 80к сосходноймутациейAsp67→Asnявилсяклассическим ГАГ-связывающим вариантом с полностью противо-

положнымисвойствами(Kozlovskayaetal.,2010).

Нами было проведено моделирование молекулярной динамики белков Е этих вирусов, которое показало значительные различия в характере движения аминокислотных остатков этих белков. Тем не менее, детальное изучение особенностей движения не проводилось.

Evidence for existence of two classes of receptors, highand low-affinity, for TBEV on the cell surface was providedearlier(Maldovetal.,1992).Structurallyand functionallydifferentmoleculeswereproposedaslowaffinity TBEV receptors. One class of such molecules were glycosaminoglycans (GAGs), linear polysaccharide molecules with multiple negatively charged sidegroups. The most promising among them are heparan sulfates, found in different types of organisms and on almost all the mammalian cells (Kim et al., 1994; Jakkola et al., 2000).

Flavivirus, including TBEV, variants with increased sorption on GAGs were obtained in laboratory during virus adaptation to the BHK-21, SW-13, and Neuro-2 cell lines or ticks of different species (Chiou and Chen, 2007; Ecker et al., 1999; Goto et al., 2003; Labuda et al., 1994; Lee and Lobigs, 2000, 2002; Lee et al., 2004; Lu et al., 2008; Mandl et al., 2001; Romanova et al., 2007; Ляпустин и др., 1987). All these GAG-binding variants carried the mutation in sE, increasing the net charge of the protein molecule. Moreover, they were characterized by a set of features, forming the GAGbinding phenotype. Its main peculiarities were small plaque phenotype in porcine kidney cell lines and low neuroinvasiveness in laboratory mice, as well as absence of hemagglutinating activity (HA) and absence ofvirionprecipitatewithantibodiesinrocketimmunoelectrophoresis (RIE) (Romanova et al., 2007). These facts allowed proposing that any charge-increasing substitution in sE leads to development of the GAGbinding phenotype.

Previously we described clone 18A of strain Absettarov TBEV with Asp67→Gly mutation, increasing sE protein net charge. Nevertheless, the clone remained highly virulent for mice (just a little bit less that the parentalstrainAbsettarov),restoredlargeplaquephenotypeinporcineembryokidney(PEK)cells,lowsorption on heparin-Sepharose (HS), an in vitro GAG model, HA, and ability to form cathode precipitate in RIE (Table 1). Simultaneously, strain 80k with analogous charge-increasing mutation Asp67→Asn was a classical GAG-binding variant with the exactly opposite properties (Kozlovskaya et al., 2010).

We performed a molecular dynamics (MD) simulation of sE molecules of these viruses that showed distinctive differences in amino acid residues movement patterns. Nevertheless, the intrinsic details of the movement peculiarities were not studied.

medical virology. vol. XXVII (2)								45
		Таблица 1. Биологические, иммунохимические и вирусологические
			свойства штаммов и клонов ВКЭ (по Kozlovskaya et al., 2010)
		Table 1. Biological, immunochemical and virological properties of TBEV
					strains and clones (Kozlovskaya et al., 2010)
TBEV strain/	Plaque size	Binding on HS		RIE (РИЭФ)2		HA	LD50 (lgБОЕ)	a.a. mutations
clone	(mm)	(ГС)1 (%)				(ГА)3	upon i/p4	in E protein5
Absettarov	9,5±1,0	25±13		+		+	0,4	–
Absettarov	7,3±0,7	24±12		+		+	2,0	Asp67→Gly
18A
SofjinKGG	8,0±0,9	0		+		+	1,6	–
80k	1,0±0,5	91±2		–		–	3,8	Asp67→Asn
								Thr68→Ala

1 HS, ГС – heparin-Sepharose (гепарин-сефароза)

2 ‘+’–presence/наличие,‘–’–absenceof cathodeprecipitateofvirionswithantibodiesin rocketimmunoelectrophoresis(RIE)/отсутствие направленногоккатодупреципитатавирионовс

антителамивракетномиммуноэлектрофорезе(РИЭФ)

3 ‘+’ – presence of HA in pH from 5.7 to 7.0/наличие гемагглютинирующей активности (ГА) при некотором значении рН в диапазоне 5,7-7,0, ‘–’ – absence of HA/ отсутствие ГА при всех значениях рН в диапазоне 5,7-7,0

4 i/p – intraperitoneal inoculation (после интраперитонеального введения)

5 a.a. – amino acid; ‘–’ signifies the absence of mutation according to consensus sequence of TBEV subtype (нумерация а.к. по последовательности белка Е ВКЭ; мутация относительно консенсусной последовательности соответствующего подтипа, для клона 18А относительно родительского штамма Абсеттаров; ‘–’ означает отсутствие подобных мутаций)

Данная работа посвящена созданию подхода к изучениюэктодоменабелкаЕметодоммолекулярнойдинамикинапримеретрёхвариантовВКЭсцельювыяснить,почемуналичиеуклона18Аштамма Абсеттаров мутации, повышающей заряд поверхностного гликопротеина, не привело к появлению ГАГ-связывающего варианта. В работе были рассмотрены штаммы Дальневосточного подтипа ВКЭ СофьинКГГ и 80к, а также клон 18А штамма Абсеттаров Европейского подтипа, описанные нами ранее. Для трёх вариантов ВКЭ был разработан подход к анализу МД, позволивший определить элемент вторичной структуры белка Е, различающий клон 18А штамма Абсеттаров и штамм 80к.

Материалы и методы

Моделированиебелковыхструктур.Моделидимеров эктодоменов белков Е для исследуемых вирусовбылипостроеныиоптимизированывпреды-

дущей работе (Kozlovskaya et al., 2010).

Вкратце, моделирование структуры по гомологии проводили только для растворимого эктодомена белка Е ВКЭ; область стебелька и якоря была исключена из рассмотрения. Аминокислотная после-

Thepresentworkisdevotedtodevelopmentofthe approachtostudysEMDonthreeTBEVvariantsaimed to elucidate why the presence of charge increasing mutation in clone 18A of strain Absettarov has not led to development of GAG-binding variant. We investigated Far-Eastern subtype TBEV strains SofjinKGG and 80k, and clone 18A of European strain Absettarov, described earlier. For these three viruses we developed and applied MD analysis approach that allowed us to find secondary structure element of sE, which distinguished clone 18A from strain 80k.

Materials and methods

Modelling of the protein structures. Models of the sE molecules for studied viruses were built and optimized in our previous work (Kozlovskaya et al., 2010). Briefly, amino acid sequence of the template protein was extracted from the structure file from PDB (access code 1SVB (Rey et al., 1995)). Amino acid sequences of the template and targets were aligned in ClustalX 2.0.11 (Larkin et al., 2007)

46	Медицинскаявирусология.томXXVII(2)

довательность шаблона была получена из файла структуры из банка белковых структур PDB (код до-

ступа 1SVB (Rey et al., 1995)). Аминокислотные по-

следовательности шаблона (штамм Найдорфл) и исследуемых белков были выровнены с помощью программы ClustalX 2.0.11 (Larkin et al., 2007) с ис-

пользованием параметров по умолчанию. Моделирование структур по гомологии было проведено программой MODELLER 9v5 (Šali and Blundell, 1993).

Координаты атомов димерного шаблона были восстановлены на основе кристаллографической симметрии в программном комплексе CCP4mg (Pottertonetal.,2002).ДляклонаАбсеттаров18А,штаммов СофьинКГГ и 80к было построено по 35 различных моделей растворимого домена, затем каждая модель прошла процедуру оптимизации. N-Ацетил-D- глюкозаминовая модификация Asn154 была оставленанетронутой.ЛучшиемоделипооценкеMODELLER DOPE score и PROCHECK validation score (Laskowski et al., 1993) были выбраны для последующей опти-

мизации, проведённой в SYBYL 8.0 (Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63144, USA) пу-

тём добавления атомы водорода и 150 итераций минимизации методом Пауэлла в силовом поле Tripos. Окончательные структуры были использованы длямоделированиямолекулярнойдинамики.

Моделирование молекулярной динамики (МД). МоделированиеМДбылопроведеноранее(Kozlovskayaetal.,2010).Егопроводилиспомощьюкомплек-

сапрограммAMBER10(Caseetal.,2008).Дляамино-

кислотныхостатковбылоиспользованосиловоеполе

AMBER ff99SB (Hornak et al., 2006), для углеводного заместителя — GLYCAM06 (Kirschner et al., 2008). За-

ряды атомов были автоматически присвоены модулем LeAP в соответствии со стандартными значениями для силовых полей. Алгоритм SHAKE (Ryckaert et al., 1977) был применён для фиксации длин связей, содержащих атомы водорода. Обобщённная модель Борна(TsuiandCase,2001)использоваласьдлямоделированияэффектоврастворителя.Предварительная минимизацияэнергиисистемысостоялаиз1500итераций методом наискорейшего спуска и 1000 итераций методом сопряжённых градиентов. Моделирование МД проводили на 256 процессорах суперкомпьютера СКИФ МГУ «Чебышёв». При этом были использованы следующие параметры: шаг 2 фс, число итераций 5 млн., температура системы поддерживаласьравной300КспомощьютермостатаЛанжевена счастотойстолкновений1пс-1.

Анализ результатов МД. Визуальный анализ траекторий был проведён в программе VMD (Humphrey et al., 1996); статистический анализ был сделан с помощью модуля ptraj пакета программ AMBER,

программ Microsoft Excel 2010 и Microcal OriginPro 8.

Анализ главных компонент траекторий проводили с помощьювеб-сервераDYNAMITE(Barrettetal.,2004).

with default parameters. Homology modelling was performed by means of the program MODELLER 9v5 (Šali and Blundell, 1993). Atomic coordinates of the dimeric template were recreated from crystallographic data with CCP4mg (Potterton et al., 2002). Thirty-five different models of the dimeric soluble domains were built for viruses Absettarov 18A, SofjinKGG, and 80k, and the simulated annealing procedure was applied to every model. The N-acetyl-D-glucosamine moiety attached to Asn154 was kept intact. The best models based on the MODELLER DOPE score and PROCHECK (Laskowskietal.,1993)validationscorewerechosen for subsequent optimization. Further optimization was performed for the models in SYBYL 8.0 (Tripos

Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63144, USA). All hydrogen atoms were added, and then 150 steps of the Powell minimization in the Tripos force field were performed. Molecular alignment and comparison were performed with SYBYL 8.0. The final structures of the models were used for molecular dynamics studies.

Molecular dynamics simulation. MD simulation was performed earlier (Kozlovskaya et al., 2010). It was performed by means of the program complex AMBER 10 (Case et al., 2008). For the protein molecule force field AMBER ff99SB (Hornak et al., 2006) was used, and GLYCAM06 (Kirschner et al., 2008) was used for the carbohydrate moiety. Atomic charges were automatically assigned in the LeAP module of the AMBER suite. The SHAKE algorithm (Ryckaert et al., 1977) was applied to constrain the lengths of the bonds containing hydrogen atoms with the aim to reduce computational time. Generalized Born solvent model (Tsui and Case, 2001) was used to mimic solvent effects. The energy of system was minimized priortotheproductiondynamicsrunwith1500iterationsofsteepestdescentmethodand1500iterations of conjugated gradients method. Production MD run was performed with sander on 256 processors of the supercomputer SKIF MSU «Chebyshyov» (Moscow State University Research Computing Center). The following parameters were used: time step – 2 fs, number of iterations – 5 million, system temperature was kept equal to 300K by Langevin thermostat with collision frequency of 1 ps–1.

Analysis of the MD results. Visual analysis of trajectories was performed with VMD (Humphrey et al., 1996), statistical analysis was performed in ptraj module of the AMBER suite, Microsoft Excel 2010, and Microcal OriginPro 8. The principal component analysis of the trajectories was also independently performed with DYNAMITE web server (Barrett et al., 2004).

medical virology. vol. XXVII (2)

47

Результаты

Анализ МД белка Е исследуемых штаммов. При анализе главных компонент траектории МД были выявлены 3 основных компоненты. Первая компонента, описывающая более 50% движения белка, соответствует его скручиванию вдоль продольной оси. Вторая и третья компонента, определяющие 15%и10%движения,соответственно,наиболеезаметныпривизуальноманализетраекторийипредставляют собой изгиб молекулы белка. Вклад каждой из остальных компонент в движение белка незначителен (Рис. 2).

Анализ корреляционных карт МД белка Е для исследуемых штаммов. На основе траекторий МД были построены корреляционные матрицы относительных движений аминокислотных остатков внутри димера белка Е, визуализированные в виде корреляционныхкарт(Рис.3).Посколькудимерэктодомена белка Е состоит из 790 аминокислотных остатков и обладает достаточно высокой симметрией, мы ограничились описанием коррелятивных движений аминокислотных остатков одной субъединицы внутри димера (395 остатков).

Results

Analysis of sE MD for studied viruses. Principal component analysis of the MD trajectories revealed three most pronounced motions. The first one describes50%ofthemovementandappearsasatwist of the sE molecule around its longest axis. Second and third components, determining 15% и 10% of the movement, respectively, are the most distinct during visual analysis of the trajectories and refer to the bending of the molecule. The remaining components have minor impact (Fig. 2).

Analysis of sE MD correlation maps for studied viruses. We built correlation matrices of amino acid residues’ movement in sE dimer during MD and visualized them as dynamics cross-correlation maps (DCCMs) (Fig. 3). As far as sE dimer contains 790 amino acid residues and possesses significant symmetry, we limited ourselves to a description of correlative movements of the residues from one subunit of the dimer (395 residues).

Рис. 2. Анализ главных компонент (с I по III) траекторий МД для димеров эктодоменов белков Е ВКЭ (штамм Абсеттаров).

Зеленоватой кривой изображена аминокислотная цепь молекулы, а синими конусами –

направление векторов движения

Fig. 2. Principal component analysis of MD trajectories of TBEV sE dimers. Porcupine plots for components I to III are shown. Molecule backbone is shown in cyan, and blue cones represent movement vectors

48	Медицинскаявирусология.томXXVII(2)

Рис. 3. Корреляционные карты движения Cα-атомов аминокислотных остатков одной из субъединиц димера эктодоменов белка Е для клона 18А штамма Абсеттаров, штаммов СофьинКГГ и 80к.

Указано расположение и нумерация остатков внутри субъединицы (от 1 до 395). Справа расположена шкала окраски по коэффициенту корреляции (от -1 до 1)

Fig. 3. DCCMs of Cα-atoms for one of the monomers of sE dimer of strain Absettarov clone 18A, strains SofjinKGG and 80k. Position and numbering of the residues in the monomer are marked (from 1 to 395). Color scale of the correlation coefficients is on the right

По осям X и Y последовательно отложены аминокислотные остатки субъединиц в димере белка Е. Точки на карте окрашены в соответствии с коэффициентами корреляции векторов движения Сα-атома остатка на оси X относительно Сα-атома остатканаосиY.Еслиостаткидвижутсяводномнаправлении, то кэффициент корреляции положителен, если в противоположных — то отрицателен. Области максимальной корреляции окрашены в красный цвет и соответствуют коэффициенту корреляции, равному 1. Зоны максимальной антикорреляции соответствуют коэффициенту корреляции –1 и окрашены в синий цвет. Нулевое значение коэффициента корреляции соответствует независимомудвижениюостатковдруготносительнодруга, и соответствующие точки окрашены в белый цвет.

Картаимеетчёткуюструктуру,соответствующую доменам белка Е (домен I содержит остатки 1–51, 136–189, 285–302, домен II — 52–135, 190–284,

домен III — 303–395). Области высокой корреляции соответствуют преимущественно движениям аминокислотных остатков внутри доменов, области значительной антикорреляции — движениям остатков одного домена относительно другого.

Сравнительный анализ характера относительногодвиженияаминокислотныхостатковэктодоменов белка Е рассматриваемых вариантов между собой мы проводили путём вычитания корреляционных карт друг из друга, чтобы определить, насколько отличаются коэффициенты корреляции каждого конкретного аминокислотного остатка в разных белках. Эти разностные матрицы в каждой ячейке содержали разность коэффициентов, которая, учитывая раз-

AminoacidresiduesofsEmonomerareplacedsequentially on X and Y axes. DCCM points are colored according to the correlation coefficients for move- mentvectorsofСα-atomsfromXaxisresiduerelative- ly to Y axis residues. If the residues move in the same direction, correlation coefficient has a positive value, if they move in opposite directions – a negative one. Regions with the maximal correlation are colored in redandhaveacoefficientof1.Regionswiththemaximal anti-correlation are colored in blue and have a coefficient of –1. Zero value of correlation coefficient referstoindependentmovementoftheresidues,and these regions are not colored.

Studied DCCMs have distinct structure defined by sE domains (domain I with residues from 1–51, 136–189, 285–302, domain II — 52–135, 190–284, domain III — 303–395). The regions of the highest correlation correspond to the correlated movements of the residues in one domain, the regions of highest anti-correlation – to the movements of the residues from different domains.

Comparative analysis of the correlated movement of sE residues of TBEV variants under consideration was performed through subtraction of DCCMs from one another. This allowed us to understand the difference between correlation coefficients of one particular residue in different sE molecules. Each cell of these difference matrices contained difference of

medical virology. vol. XXVII (2)

49

Рис. 4. Матрицы вычитания корреляционных карт движения Cα-атомов аминокислотных остатков одной из субъединиц димера эктодоменов белка Е для клона 18А штамма Абсеттаров, штаммов СофьинКГГ и 80к. Окрашенные ячейки соответствуют величине разности коэффициентов корреляции более |0,9|, |0,7|, |0,5|, соответственно

Fig. 4. Differential DCCMs of Cα-atoms in one monomer of sE dimer of strain Absettarov clone 18A, strains SofjinKGG and 80k. Colored cells correspond to the values of correlation coefficients over |0.9|, |0.7|, |0.5|, respectively

брос значений корреляционных коэффициентов, могла лежать в диапазоне значений от –2 до 2. Однако,всеячейкивсехпостроенныхматрицразности содержализначениявдиапазонеот–1до1,чтосви- детельствует о высокой схожести движений аминокислотныхостатковэктодоменовбелковЕВКЭ,даже принадлежащихкразличныхподтипам.

Для обнаружения областей с наиболее выраженнымиотличиямимыисключалитеячейки,значения в которых были по модулю меньше порогового значения. Эти области окрашивались в белый цвет (Рис.4).

correlation coefficients, which according to the distributions of the initial values could be from –2 to 2. However, all cells of all built differential DCCMs containedvaluesfrom –1to1thatindicatedhighsimilar- ity of sE molecules of TBEV variants even belonging to the different subtypes.

Toidentifytheregionswiththemostdistinctivedifferences we excluded from the consideration the cells with absolute values lying below a threshold. These regions were colored white in Fig. 4.