Лабораторна робота № 4

Тема: Будова бактеріальної клітини. Диференційні методи забарвлення

Мета: Вивчити будову прокаріотичних організмів, оволодіти складним методом забарвлення за Грамом.

Матеріали й устаткування: культури мікроорганізмів, що вирощені на агаризованому середовищу: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Streptococcus lactis, Saccharomyces cereviceae та ін, мікроскопи МБР, МБД, стерильні піпетки, бактеріологічна петля, пінцет, препарувальна голка, тонкі предметні стекла, покривні скельця, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, крапельниці з фарбами, 96-ний спирт, імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, промивалка з дистильованою водою.

Барвники для забарвлення за Грамом:

1. Феноловий розчин генціана фіолетового: генціан фіолетовий – 1 г, спирт 96%-ний – 10 мл, фенол кристалічний – 2 г, вода дистильована – 100 мл.

2. Розчин Люголя: йодид калію –2 г, йод кристалічний – 1 г, вода дистильована – 300 мл. Спочатку готують концентрований розчин йодиду калію в 5 мл води, у ньому розчиняють йод, потім додають воду до 300 мл.

3. Фуксин Пфейфера: 1 мл карболового фуксину Циля і 9 мл дистильованої води.

Теоретичні положення

Мікробна клітина – складна жива система, що характеризується високим ступенем упорядкованості складових її структур; кожна структура має визначену життєву функцію і їхня взаємодію між собою забезпечує існування клітини, її цілісність.

Для вивчення внутрішньої будови клітин застосовують спеціальні методи забарвлення – цитохімічні методи дослідження. Багато з цих методів переслідують діагностичні цілі. За формою клітини мікроорганізми не занадто різноманітні, та в ряді випадків, щоб установити приналежність мікроба до того чи іншого роду й виду, необхідно провести спеціальне забарвлення клітини чи речовини, що накопичується в ній.

Порядок виконання роботи

1. Вивчити ультраструктуру бактеріальної клітини.

Розглянути мікрофотографії мікроорганізмів, що одержані за допомогою електронного мікроскопа. Замалювати схематичну будову узагальненої бактеріальної клітини (додаток 2).

2. Забарвити бактерії за Грамом

Забарвлення за Грамом є найбільш універсальним із диференціальних методів фарбування мікробних кліток. Він заснований на розходженні в хімічному складі клітинних оболонок і має важливе діагностичне значення у визначенні видів бактерій. Усі бактерії щодо цього методу фарбування поділяються на грампозитивні й грамнегативні.

Сутність фарбування полягає в тім, що грампозитивні утримують комплекс генціанового фіолетового з йодом під час обробки препарату спиртом і тому забарвлюються в синьо-фіолетовий колір. У грамнегативних мікроорганізмів це сполучення з'являється тимчасово і знебарвлюється після обробки спиртом. У наступному фарбуванні фуксином вони здобувають рожево-червоний колір. Здатність клітин забарвлюватися за Грамом залежить від віку культури: у старій культурі мертві клітини завжди забарвлюються грамнегативно. Деякі бактерії (коринебактерії, протей) офарблюються грамваріабельно. Фарбувати за Грамом необхідно клітини молодих (частіше однодобових) культур. Доцільно також офарблювати клітини контрольних мікроорганізмів, відношення яких до забарвлення за Грамом заздалегідь відомо. Мазок для фарбування за Грамом повинний бути тонким, щоб клітини рівномірно розподілялися на поверхні скла і не утворювали скупчень.

Техніка фарбування за Грамом

На добре знежиреному предметному склі готують три тонких мазки різних культур мікроорганізмів: у центрі наносять мазок досліджуваного мікроорганізму (чи суміші грамнегативних і грампозитивних бактерій), по краях – контрольних культур. Клітини однієї контрольної культури повинні бути грампозитивними (наприклад, Staphylococcus aureus), іншої – грамнегативними (наприклад, Escherichia coli).

Мазки висушують у повітрі і фіксують над полум'ям пальника. Фіксація хімічними сполуками не рекомендується.

На фіксований мазок наливають розчин карболового генціанового чи кристалічного фіолетового. Мазки офарблюють протягом 1хвилини.

Барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, обробляють його розчином Люголя протягом 1 хвилини до повного почорніння.

Зливають розчин Люголя і препарат, не промиваючи водою, обробляють із безперервним погойдуванням 96%-ним етиловим спиртом протягом 15-20 с. Час знебарвлення дуже істотний, за умов переривання зазначеного терміну знебарвлюються і грампозитивні клітини, якщо термін обробки надлишковий терміну препарат виявиться перефарбованим.

Промивши препарат водою, його додатково офарблюють протягом 1 хвилини водяним фуксином Пфейфера. Барвник зливають, препарат знову промивають водою, висушують і проводять мікроскопію з імерсійною системою. Грампозитивні бактерії за умов правильного фарбування набувають синьо-фіолетовий колір, грамнегативні – червоно-рожевий колір фуксину.

Метод Грама в модифікації Синєва

На фіксований мазок накладають смужку фільтрувального папера шириною 3 см, що попередньо просочена 1%-ним розчином кристалічного фіолетового та висушена (у висушеному вигляді папір може довго зберігатися). На папір наносять 2-3 краплі води і залишають його на препараті 2 хв. Надалі фарбування проводять за вищеописаною методикою. Модифікація Синєва знайшла широке застосування в практиці.

Метод Грама в модифікації Калини

На предметне скло наносять невелику краплю дистильованої води, поміщають у неї мінімальну кількість кліток мікроорганізмів і петлею додають 0,5%-ний спиртовий розчин кристалічного фіолетового. Суспензію рівномірно розподіляють на площі 1 см², підсушують і фіксують однократним проведенням над полум'ям пальника. Після цього препарат протягом 1 хвилини обробляють реактивом, що містить 10 мл 5%-ного розчину фуксину Пфейфера, 10 мл 10%-ного розчину йоду, 10 мл ацетону і 70 мл 0,5%-ного йодиду калію. Потім препарат опускають на мить у 96%-ний етиловий спирт і швидко висушують фільтрувальним папером.

Результати спостережень відобразити у вигляді малюнків. Указати назву об'єкта, відзначити морфологічні особливості організмів.

Препарати, перш, ніж вимити, поміщають у дезінфікуючий розчин.