2. Виявлення ендоспор у бактерій

Спори бактерій у порівнянні з вегетативними клітинами мають високу стійкість до несприятливих умов зовнішнього середовища. Вони являють собою округлі, овальні чи еліпсоїдальні утворення. Якщо діаметр спори не перевищує діаметра клітини, у якій утворилася спора, клітина називається бацилярною, якщо перевищує, то в залежності від розташування спори – у центрі чи на кінці клітини – клостридіальною чи плектридіальною. У бацилярній клітині спора може розміщатися центрально, термінально або ексцентрально. Спори бактерій можна розрізнити по більш сильному заломленню світлових променів.

Більш надійний метод виявлення спор полягає в диференційному забарвленні клітин та спор, що заснований на різній здібності забарвлюватися барвниками та утримувати його під час обробки водою чи кислотою. Виявлення здатності культури до спороутворення краще проводити в старих культурах. Спори кислотостійкі, тому важко забарвлюються барвниками. Пояснюється це великою щільністю оболонки, низькою концентрацією води і високим умістом ліпідів. У препаратах, що пофарбовані простими способами чи за Грамом спори залишаються безбарвними. Усі наявні способи фарбування спор засновані на тому, що спочатку сильним барвником із прогріванням фарбують одночасно й клітину й спору. Потім протоплазму клітини знебарвлюють, залишаючи спори забарвленими. Після цього протоплазму фарбують додатково в інший, найчастіше, контрастний колір.

2. 1. Спосіб Ожешки

На знежиреному предметному склі готують тонкий мазок бактерій (наприклад, Bacillus subtilis, Saccharomyces cereviceae), висушують його у повітрі, не фіксуючи, заливають 0,5%-ним розчином соляної кислоти і підігрівають протягом 2 хвилин, тримаючи високо над полум'ям пальника до випарування.

Кислоту зливають, препарат промивають водою, мазок закривають фільтрувальним папером і заливають карболовим фуксином Циля. Забарвлюють мазок упродовж 5 хвилин із нагріванням над полум'ям пальника до появи пару. По мірі випарування барвника його періодично додають, не даючи препарату підсохнути. Препарат знову промивають водою й обробляють протягом 2 хвилин 1%-ним розчином сірчаної кислоти для знебарвлення. Препарат ще раз промивають водою і дофарбовують розчином метиленового синього 1:40 протягом 10-15 хв. Барвник зливають, препарат промивають водою, висушують і потім виконують мікроскопію з імерсійною системою. За умов правильного фарбування бактеріальні клітини повинні бути синіми, а спори червоними.

2. 2. Спосіб Пєшкова

На знежиреному предметному склі готують тонкий мазок бактерій, висушують його у повітрі і фіксують над полум'ям пальника. На фіксований мазок наливають розчин метиленового синього (за Льоффлером) і доводять його до кипіння, тримаючи препарат над полум'ям пальника. Кип'ятять протягом 15-20 сек. По мірі випарування розчину метиленового синього додають нові порції барвника. Препарат ретельно промивають водою, після чого клітини дофарбовують 0,5%-ним водяним розчином нейтрального червоного протягом 30 сек. Барвник зливають, препарат знову промивають дистильованою водою, висушують і розглядають з імерсійною системою. За умови правильного дотримання всіх стадій обробки й фарбування препарату клітини здобувають червоний колір, а спори синій.

У випадку виявлення в мікроорганізмів здатності до спороутворення необхідно відзначити його тип (бацилярний, клостридіальний чи плектридіальний), розташування спори в клітині, форму вільних спор.

2. 3. Спосіб Циля

Підготовлений на предметному склі мазок висушують у повітрі, фіксують над полум’ям пальника, обробляють 5%-ним розчином хромової кислоти впродовж 5-10 хвилин і промивають водою. Зафарблюють карболовим фуксином Циля з одночасним обережним нагріванням упродовж 2-3 хв. Для цього предметне скло утримують пінцетом і нагрівають над полум’ям пальника до появи пару (але не до кипіння). По мірі випарування барвника необхідно додавати його краплями, не допускаючи підсихання. Потім знебарвлюють препарат 1%-ним розчином сірчаної кислоти впродовж 10-15 с, негайно змивають препарат водою (спори залишаються забарвленими у червоний колір, а мікробні клітини знебарвлюються). Додатково дофарбовують препарат метиленовим синім 20 хв. Промивають водою, висушують і виконують мікроскопію з імерсією. За умови правильного забарвлення мікробні клітини повинні бути синіми, спори – червоними, фон – знебарвлений.