Лабораторна робота № 16

Тема: Загальний мікробіологічний аналіз грунту

Мета: Визначити кількість мікроорганізмів у пробах досліджуваного ґрунту.

Матеріали й устаткування: наважка грунту 10 г, 2 колби з 100 мл стерильної води, чашки Петрі з стерильними МПА (на 2-х студентів), 2 стерильні піпетки на 1 мл, скляні шпателі, спиртівки, поживні середовища КАА, Чапека, Ешбі, Виноградського, ґрунтова витяжка по Фішеру, середовище Гетчинсона, мікроскопи, імерсійна олія, фільтрувальний папір, предметні скельця, бактеріологічна петля, фізіологічний розчин, дистильована вода, барвники за Грамом.

Теоретичні положення

Ґрунт є середовищем для існування більшості мікроорганізмів. У ньому живуть бактерії родів Pseudomonas, Bacterium, Arthrobacter, Mycobacterium, Bacillus, Clostridium, багато чисельні види грибів, водоростей, найпростіших.

Для визначення чисельності представників еколого-трофічних груп ґрунтової мікрофлори користуються методами:

1) прямого підрахунку клітин під мікроскопом (метод Виноградського);

2) культивування мікроорганізмів на поживних середовищах.

Метод Виноградського дає достовірні, але завищені дані, бо ним неможливо розрізнити живі і мертві клітини мікроорганізмів.

Для визначення кількості життєздатних клітин у ґрунті користуються методами висіву ґрунтової суспензії на тверді та рідкі поживні середовища. Ці методи дають занижені дані, бо виростають не всі мікроорганізми ґрунту, а лише ті, які здатні до росту на вибраних для досліду середовищах. Методами культивування визначається лише десята частина від кількості мікроорганізмів, що виявляється методом прямого мікроскопування.

Методи культивування досить різноманітні. Запропоновано багато способів посіву і велику кількість поживних середовищ.

Найчастіше використовують метод висіву мікроорганізмів з водної суспензії на тверді середовища в чашках Петрі або на рідкі середовища в пробірках.

Порядок виконання роботи

Робота складається з кількох етапів

1. Взяття середньої ґрунтової проби і підготовка зразку.

Середню ґрунтову пробу одержують, змішуючи окремі зразки, кількість яких залежить від мікрорельєфу (рівний, хвилястий, уклін) та площі. Рекомендують з площі 100 м² брати пробу з трьох точок, з більше ніж 100 м² – з п’яти точок, з 1 га – більше 15 точок. При дослідженні пашні проби беруть з глибини всього орного шару, знімаючи верхній 2-сантиметровий шар, при дослідженні мікрофлори ґрунтового профілю – по генетичним горизонтам (знизу вверх).

Ґрунтовий зразок беруть стерильним буром, стерильною лопатою і стерильним ножем в заздалегідь підготовлену скляну широкогорлу банку, яка закривається корковою пробкою, обгорнутою стерильною ватою, в стерильні поліетиленові або пергаментні мішки. На пакети, банки наклеюють етикетки із зазначенням місця взяття проби, горизонту та інших даних.

Бур, лопату, ніж в полі перед взяттям зразку ретельно очищують, потім обпалюють гарячим спиртом.

Ґрунтові зразки аналізують в першу добу. При необхідності допускається зберігання їх в холодильному приміщенні (холодильнику) на протязі двох днів. Для більшої однорідності середнього зразку, дотримуючись усіх правил асептики, його ретельно перемішують, виймаючи корені рослин, різні включення.

2. Приготування ґрунтової суспензії та посів.

На стерильному часовому склі стерильним шпателем (або амонієвою ложкою) розмішують 10 г грунту. Щоб при зважуванні в грунт не попали бактерії з повітря, часове скло накривають другим часовим склом. (Шпателі, ложки, скельця стерилізують фламбуванням). Наважку грунту переносять в колбу на 250 мл з 90мл стерильної водопровідної води, збовтують 10 хвилин на механічній гойдалці і дають відстоятися грубим часткам грунту.

Одночасно зі взяттям наважки для аналізу з середньої проби відбирають 10-20 г грунту для визначення вологості, так як одержані при аналізі дані перераховують на 1 г абсолютно сухого грунту.

Встановлено, що більше мікроорганізмів виявляється, якщо наважку заздалегідь помістити в стерильну фарфорову чашку або ступку, зволожити (0,4-0,8 мл води або 0,1 % розчином пірофосфату Na₄P₂O₇ на 1 г грунту) і 5 хвилин розтирати стерильним резиновим пестиком або пальцем в стерильній резиновій рукавиці до пастоподібного стану.

Перед приготуванням суспензії для кожного зразку готують дві стерильні колби на 250 мл, одна містить 100 мл стерильної водопровідної води, друга – пуста. Водою з першої колби розтерту ґрунтову масу змивають в пусту стерильну колбу. Колбу з суспензією струшують 5 хвилин, залишають на 30 с і готують розведення, які містять різні концентрації грунту. 1 мл суспензії в першій колбі відповідає розведенню 10^-1. Послідуючі розведення (10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 і т. д.) краще робити в колбах на 250 мл з 90 мл стерильної водопровідної води.

З кожного попереднього розведення окремою стерильною піпеткою беруть 10 мл суспензії і переносять в наступну колбу з 90 мл Н₂О. Кожний раз піпетку споліскують і залишають. Наступні колби струшують по 1 хвилині. З одержаних розведень проводять висіви на щільні та рідкі середовища. Набір середовищ залежить від задач бактеріологічного аналізу грунту.

На щільні поживні середовища висів роблять поверхнево. Для цього агаризовані поживні середовища розливають в стерильні шашки Петрі і після охолодження підсушують в термостаті при 40°С. На поверхню агаризованої пластини стерильною градуйованою піпеткою наносять 0,05 мг ґрунтової суспензії із відповідного розведення, потім скляним шпателем Дригальського розтирають краплю до висихання, при цьому відкриту чашку тримають у вертикальному положенні біля полум’я горілки. Посів з кожного розведення проводять мінімум на 2-3 паралельні чашки.

При визначенні кількості бактерій в грунтах орного шару для посіву на МПА, крохмально аміачному агарі (КАА), середовищі Чапека використовують розведення 10^-3, 10^-4 ; на сусло-агарі, МПА + сусло-агарі, бідних середовищах (нітратний агар), на середовищі Ешбі застосовують розведення 10^-2 і 10^-3. Для грунтів нижчих горизонтів відповідно використовують розведення на один порядок менше. В ряді глибинного посіву беруть 1 мл ґрунтової суміші з меншого розведення (на порядок менше), ніж для поверхневого посіву.

Суспензію вносять в стерильну чашку Петрі, заливають агаром, розплавленим та охолодженим до 45°С і перемішують з ним. При глибинному посіві показники є більш низькі, чим при поверхневому.

При підрахунках мікроорганізмів грунту на різних середовищах останні розливають в колби або пробірки на 20 мл і стерилізують (на 1,5 атм 30 хвилин). З кожного розведення, починаючи з самого високого, окремо стерильною піпеткою беруть по 1 мл суспензії і переносять в рідке середовище. З кожного розведення засівають мінімум дві пробірки або колби (краще 3-5).

Коли чисельність окремих груп мікроорганізмів в грунті невелика, їх виявляють методом обростання грудочок грунту за Виноградським. Відмиті від залишків хлору і прокип’ячені або простерилізовані гелеві пластини промивають 3-5мл елективного середовища, для відповідної групи мікроорганізмів. Середовище упарюють в сушильній шафі при 40-50°С до утворення емалевої поверхні. По поверхні розкладають по трафарету 40-50 грудочок грунту діаметром 1-2 мм. Чашки розташовують в вологу камеру і ставлять в термостат. Якщо в грудочках грунту знаходяться відповідні мікроорганізми, то вони починають розвиватися і формують навколо грудочок колонії. Потім розраховують відсоток оброслих грудочок грунту від їх вихідного числа. Після певного часу інкубації при 20-30°С культури мікроорганізмів аналізують.

3. Виявлення мікроорганізмів на поживних середовищах.

Групи мікроорганізмів, які виявляються на щільних середовищах

Мікроорганізми, які використовують органічні форми азоту, виявляють на МПА. Для підрахунку бацилярних форм мікроорганізмів по Е.Н. Мішустіну рекомендують застосувати змішаний агар: МПА + сусло у співвідношенні 1:1. МПА готують звичайним методом, сусло-агар – з 7-балингового сусла (рН 7,0) і 2 % агару. Змішують МПА і сусло-агар перед посівом і розливають в чашки Петрі.

Ґрунтову суспензію із відповідного розведення (10^-1, 10^-2) пастеризують перед посівом при 70°С 15 хвилин. Бацилярних форм виявляється більше, якщо грунт перед приготуванням розведень підсушують при кімнатній температурі.

Мікроорганізми (в тому числі актиноміцети), які використовують мінеральні форми азоту, частіше виявляють на КАА, який містить, г/л дистильованої води: крохмаль (-розчинний) – 10,0; (NH)₂SO₄ – 2,0; К₂НРО₄ – 1,0; MgSO₄·7H₂O – 1,0; NaCl – 1 %; СаСО₃ – 3,0; агар – 20,0. Крохмаль додають до середовища, попередньо розчинивши його в невеликій кількості води.

Для виявлення цієї групи мікроорганізмів можна застосовувати і середовище Чапека наступного складу: г/л дистильованої води: сахароза або глюкоза – 20,0; NaNO₃ – 2,0; К₂НРО₄ – 1,0; MgSO₄·7H₂O – 0,5; КCl – 0,5; СаСО₃ – 3,0; агар – 20,0.

Мікроорганізми, які приймають участь в мінералізації гумусових речовин (автохтонна мікрофлора), виявляють на наступних середовищах.

Водний агар (по Ерскаву). До 1 л водопровідної води додають 2-2,5 % добре відмитого агару і стерилізують при 120°С.

Агаризована ґрунтова витяжка. До 1 л ґрунтової витяжки додають 0,5 г К₂НРО₄ і 20-25 г агару. Середовище стерилізують при 0,5 атм 30 хвилин. Ґрунтову витяжку краще готувати за Фішером. До 1 кг грунту з високим вмістом гумусу приливають 1 л 0,1 %-ного NaСО₃ і нагрівають в автоклаві при 115°С 30 хвилин. Витяжку фільтрують через складчастий паперовий фільтр. Якщо фільтрат мутний, то його освітлюють кип’ятінням з тальком і знову фільтрують. До 100 мл екстракту добавляють 900 мл води.

Представники автохтонної мікрофлори краще виявляються на нітратному агарі, який виготовлено за методом Вернадського.

Нітратний агар інгібує ріст бацилярних форм, які подавляють мікроорганізми автохтонної групи. Нітратний агар готують наступним чином. До середовища для другої фази нітрифікації добавляють 20 г/л добре вимоченого в дистильованій воді агару і стерилізують при 0,5 атм 30 хвилин.

Азотобактер і оліготрофні мікроорганізми (в тому числі дріжджі Lipomyces) підраховують на середовищі Ешбі. Мікобактерії із грунту та інших місць знаходження виявляють на середовищах, які рекомендовані А.А. Іншинецьким, Л.І. Солнцевою.

Гнійний агар. Беруть 100 г кролячого гною і відварюють в 1 л водопровідної води. До одержаного відвару після фільтрації через марлю добавляють 5 г крохмалю, 20 г агару і стерилізують при 0,5 атм 30 хвилин.

Грибний агар. 50 г грибів відварюють в 1 л водопровідної води. Одержаний відвар фільтрують. В фільтрат вносять 5 г крохмалю і 20 г агару, стерилізують при 0,5 атм 30 хвилин.

Мікроскопічні гриби визначають на сусло-агарі, або на кислому середовищі Чапека. Для приготування сусло-агару беруть 7-балингове сусло, розводять в 3 рази водою і добавляють 2 % агару. Середовище стерилізують в автоклаві при 0,5 атм 30 хвилин або кип’ятильнику Коха при 100°С 30 хвилин 3 рази через добу (дробна стерилізація). Перед додаванням до ґрунтової суспензії розплавленого сусло-агару приливають 2 мл стерильної молочної кислоти (на 1 л субстрату) або 0,5 г стерильної лимонної кислоти. При приготуванні середовища Чапека для грибів в середовище, яке приготовлено для виявлення актиноміцетів, 2-заміщений фосфат калію замінюють еквівалентною кількістю 1-заміщеного фосфату калію. Перед тим, як розплавлене середовище Чапека внести в чашки Петрі, до нього додають 4 мл (на 1 л) стерильної концентрованої молочної кислоти.

Групи мікроорганізмів, які виявляються методом обростання грудочок грунту

Цим методом виявляються мікроорганізми, що розкладають целюлозу. Для визначення якісного складу і відносної оцінки наявності їх в грунті використовують гелеві пластини, або пластини з “голодного” агару. На пластинах розташовують кружок стерильного фільтрувального паперу, який зволожений середовищем Виноградського або Гетчинсона. Потім по фільтрувальному паперу розміщують (по трафарету) 50 грудочок ґрунту діаметром 1-2 мм. Середовище Гетчинсона, г/л дистильованої води: NaNO₃ – 2,5; КН₂РО₄ – 1,0; MgSO₄·7H₂O – 0,3; NaCl – 0,1; СаСl₂ – 0,1; FeCl – 0,01; рН середовища доводять до 20 % розчином NaСO₃.

Нітрифікуючі бактерії виявляють на гелевих пластинах, які оброблені 5 мл поживного середовища Виноградського для першої та другої фази нітрифікації. Пластини підсушують в сушильній шафі при 40-50°С до утворення сріблястої (емалевої) поверхні, по ним розкладають грудочки грунту діаметром 1-2 мм.

Азотобактер також добре виявляється на гелевих пластинах, які оброблені 3-5 мл поживним середовищем Виноградського.

4. Визначення чисельності різних груп мікроорганізмів

Підрахунки мікроорганізмів на щільних середовищах (на 1 г абсолютного сухого грунту). Після інкубації засіяні середовища виймають з термостату і в них підраховують число колоній. Одночасно, після висушування бюксів з наважками при 105°С до постійної маси, визначають вміст абсолютно сухого грунту в 1 г сирого ґрунту.

При підрахунку колоній на багатих щільних поживних середовищах (МПА, МПА + сусло-агар, сусло-агар, середовище Чапека, середовище Ешбі і т.д.) закриті чашки Петрі розглядають в прямому світлі з зовнішньої сторони. Колонії відмічають чорнилом або тушшю. Щоб не пропустити мілкі колонії, чашки додатково проглядають під лупою. Якщо на чашці більше 200 колоній, то їх потрібно підраховувати за допомогою камери Вольфюгеля.

Число колоній на бідних середовищах (нітратний агар, “голодний” агар, агаризований ґрунтовий екстракт і т.д.) визначають під мікроскопом (окуляр 10х, об’єктив 3х, або 8х). В чашках Петрі спочатку підраховують 100 полів зору, потім виводять середнє арифметичне на одне поле. Для визначення числа колоній в чашці середнє число на одне поле зору переводять на загальну її площу. Установлюють площу чашки Петрі (Р) і площу поля зору (р), з тим, щоб виявити площу чашки. Для цього площу чашки ділять на площу поля зору і одержують коефіцієнт К (Р/р = К), на який помножують середнє число колоній в полі зору на чашці. Установлюють діаметр чашки Петрі візуально, а поле зору – під мікроскопом, використовуючи для малих збільшень міліметровий папір, а для великих (об’єктиви 40х і 90х) – об’єктивний мікрометр.

Підрахувавши при поверхневому посіві число колоній на чашці, знаходять вміст зародків в 1 мл відповідного розведення, помножуючи число колоній на 20, так як посіяно було 0,05 мл. Щоб визначити кількість клітин в 1 г сирого ґрунту, їх вміст в 1 мл помножують на ступінь розведення (10³, 10⁴, 10⁵ і т.д.). Для підрахунку мікроорганізмів в 1 г абсолютно сухого ґрунту ділять на кількість абсолютно сухого грунту, яке міститься в 1 г сирого грунту.

При глибинному посіві число колоній на 1 г абсолютно сухого грунту підраховують таким же чином, але не помножуючи на 20, так як при висіві використовують 1 мл суспензії.

Підрахунок краще вести на 1 г гумусу або на 1 мг азоту.

Підрахунок мікроорганізмів на МПА роблять візуально на 4 добу після засіву. При наявності колоній Вас. mycoides кількість мікроорганізмів визначають на 2 або 3 день. Після підрахунків всіх колоній на чашці їх згруповують по культуральним ознакам і визначають роди (а іноді і види) мікроорганізмів.

Підрахунок грибів на агаризованих середовищах. Колонії грибів на сусло-агарі або середовищі Чапека підраховують через 2 доби інкубації. Після семи днів визначають їх родовий склад. В грунті часто зустрічаються гриби родів Mucor, Rhizopus, Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Trichoderma, Trichothеcium та ін.

При мінімальній технічній похибці досліду можлива статистична обробка матеріалу. Найбільш вірогідна кількість мікроорганізмів в 1 г (1мл) вихідного субстрату при рівні достовірності 95 %. Якщо рівень достовірності 98 %, то (t)-критерій дорівнює 2,7.

Розрахунки та облік чисельності колоній мікроорганізмів проводити за схемою, що наведена у таблиці.

С.М. Виноградський запропонував підраховувати клітини на фіксованих фарбованих мазках. Для цього ґрунтову суспензію (1г ґрунту:100 мл води) після 1,5-2 хвилин відстоювання стерильною піпеткою наносять на предметне скло – 0,01 мл. Нанесена краплина розподіляється по склу на площі 4 см². Мазок висушують, фіксують, фарбують за Грамом, мікроскопують з імерсією. Підраховують кількість клітин у 100 квадратах окулярної сітки, або в 100 полях зору окуляра. Знаючи площу квадрата окулярної сітки і об'єм використаної суспензії, вираховують кількість мікроорганізмів у 1 г ґрунту.

Чисельність колоній мікроорганізмів, які виросли на МПА

Розведення	Повторність	Кількість колоній в чашках	∑х	х	δх	Найбільш вірогідна кількість мікроорганізмів в 1 г вихідного субстрату при Р0 95
10^-2	1
10^-3	2
10^-4	3
10^-5	4
	5