Лабораторна робота № 15

Тема: Біологічна фіксація азоту. Дослідження вільноживучих та симбіотичних азотфіксаторів.

Мета: Ознайомитися з вільноживучими та симбіотичними азотфіксаторами.

Матеріали й устаткування: мікроскопи, бактеріологічні петлі, набір фарб, предметні скельця, стерильна вода, імерсійне масло, спиртівки, чашки Петрі із стерильним безазотистим середовищем Ешбі (1 на двох студентів), шпателі для розкладання ґрунту, грунт у чашках Петрі, пінцети, скальпелі, 96 %- ний етиловий спирт, свіжий корінь бобової рослини з бульбочками, ботанічна бритва, препарувальні голки.

Теоретичні положення

Кожного року з урожаєм сільськогосподарських культур з грунту виноситься 100-120 млн. т азоту. З мінеральними азотними добривами повертається в грунт лише 15-25 % від зазначеної кількості. При такому співвідношенні запас азоту в ґрунтах міг би вичерпатися за 50-75 років, однак цього не відбувається. Пояснюється це тим, що дефіцит його в ґрунті поповнюється за рахунок азоту атмосфери, який зв'язується біологічним шляхом.

Процес біологічної фіксації молекулярного азоту з утворенням з нього органічних азотистих сполук мікробних клітин називається азотфіксацією. Останню здійснюють азотфіксуючі мікроорганізми. Азотфіксатори бувають вільноживучі (живуть у грунті самостійно) і симбіотичні (живуть у симбіозі з вищими рослинами).

Головними представниками вільноживучих азотфіксаторів є аеробні бактерії родів Azotobacter, Beijerinckia, анаеробні бактерії роду Clostridium, а також багато видів ціанобактерій (синьо-зелені водорості). Типовий представник анаеробних азотфіксаторів – Clostridium pasteurianum – належить до маслянокислих бактерій.

В молодій культурі Clostridium pasteurianum клітини мають форму паличок з перитрихіальним розташуванням джгутиків, потім клітина утворює спору, яка може розташовуватися ближче до краю, а частіше всередині клітини. Спори овальні, покриті кожурою. Клітини мають клостридіальну форму, накопичують гранульозу, яка зафарблюється при дії розчину Люголя в синьо-фіолетовий колір. В період утворення спор гранульоза зникає. Зустрічаються в грунтах, забруднених водоймах тощо.

Усі представники роду Azotobacter – аеробні, грамнегативні, великі клітини, можуть окислювати органічні сполуки, живуть лише при нейтральній реакції середовища (рН не нижче 6,0). Найпоширеніший вид – Azotobacter chroococcum. У молодому віці – це паличкоподібні, рухомі клітини, з віком заокруглюються й розташовуються попарно ("вісімки"). Клітини назовні оточені товстою слизовою капсулою. Бактерії цього виду утворюють темний пігмент меланін, який надає колоніям характерне буре забарвлення. За рік азотобактер фіксує 20-30 кг/га азоту. Бактерії роду Beijerinсkia sp. відрізняються від роду Azotobacter sp. більшою стійкістю до кислотності грунтів і можуть розмножуватися при рН 3,0

Бульбочкові бактерії живуть на коренях бобових рослин (рід Раріlіопасеае). Проникаючи всередину кореневих волосків, вони утворюють нарости – бульбочки різної форми, розмірів і забарвлення.

Рід Rhizobium – це група аеробних, грамнегативних, неспороутворюючих бактерій. Мають складний цикл розвитку. Рухомі паличкоподібні клітини з віком гублять джгутики, нерівномірно фарбуються, а потім перетворюються у потовщені, роздуті грушоподібні або розгалужені утворення – бактероїди, які мають розпадатися на кокоподібні клітини.

Бульбочкові бактерії відрізняються специфічністю – кожний вид бактерій утворює бульбочки лише на коренях певних культур: люпину, сої, гороху, вики, квасолі, конюшини та інших; вірулентністю, тобто здатністю швидко проникати у кореневі волоски рослин, та активністю – здатністю фіксувати азот атмосфери. Неактивні штами бульбочкових бактерій утворюють на коренях дрібні зеленуваті бульбочки, в яких фіксація азоту не відбувається. Активні штами утворюють великі рожеві бульбочки, в яких азотфіксація відбувається дуже інтенсивно. Нітрагін готують з високо вірулентних та високоактивних штамів. Бульбочкові бактерії у симбіозі з бобовими рослинами можуть зв'язати за рік азоту: під люцерною – 500, під конюшиною – 300, під люпином – 150, під зернобобовими – 60-90 кг/га.