Лабораторна робота № 5

Тема: Диференційні методи забарвлення капсул, спор, включень

Мета: Ознайомитися з особливостями будови прокаріотичних організмів, оволодіти складними методами виявлення деяких структур (капсул, спор) і включень мікробної клітини.

Матеріали й устаткування: накопичувальні й чисті культури різних морфологічних груп: Streptococcus lactis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Saccharomyces cereviceae, Clostridium butyricum та ін, мікроскопи МБР, МБД, стерильні піпетки на 1-2 мл, бактеріологічна петля, пінцет, препарувальна голка, тонкі предметні стекла, покривні скельця, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, крапельниці з фарбами: метиленовий синій (1:40), карболовий фуксин Циля, 1%-ний розчин генціанвіолета,2%-ний розчин сульфату міді, формалін, розчин J₂ у KJ (7 г йоду і 20 г йодиду калію на 100 мл дистильованої води), судан III (0,1 г судану розчиняють у 200 мл 96%-ного спирту), суміш Нікіфорова, стерильний розчин чорної туші, імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, промивалка з дистильованою водою.

Порядок виконання роботи

1. Фарбування капсул

Деякі види бактерій утворюють слизисті капсули з полісахаридів, іноді поліпептидів і води. Звичайні методи забарвлення залишають їх безбарвними. Для виявлення бактерій застосовують спеціальні негативні методи фарбування.

1.1. Виявлення капсул у негативному рідкому прижиттєвому препараті

На добре знежирене предметне скло мікробіологічною петлею наносять велику краплю чорної туші й у неї – краплю досліджуваної культури мікроорганізмів. Суміш ретельно перемішують і накривають покривним склом. Покривне скло обережно притискають до предметного смужкою фільтрувального паперу. Виконують мікроскопію препарату, користаючись об'єктивом 40х. На темному фоні туші виявляються прозорі зони капсул навколо різко обкреслених клітин.

1.2. Негативний метод Буррі

Краплю туші (1:9) поміщають на добре знежирене предметне скло і змішують із краплею рідини, що містить бактерії. За допомогою покривного скла розподіляють мазок тонким шаром на поверхні предметного скла. Після того як препарат висохне у повітрі, виконують його мікроскопію, користаючись об'єктивом МІ-90. У полі зору мікроскопа на загальному темно-димчастому тлі чітко видні незабарвлені капсули й клітини мікроорганізмів.

1.3. Фарбування капсул за методом Буррі - Гінса

На кінець предметного скла мікробіологічною петлею наносять краплю чорної туші й у неї вносять досліджуваний матеріал. Рідину перемішують ребром покривного чи іншого предметного скла роблять мазок по всій поверхні препарату (по типу мазка крові). Мазок висушують у повітрі і фіксують у полум'ї пальника чи абсолютним етанолом 3 хв. Далі мазок забарвлюють карболовим фуксином Циля, який розводять водою в співвідношенні 1:3, забарвлення триває 2-3 хв. Препарат промивають водою, висушують у повітрі і виконують мікроскопію з імерсією. На темно-сірому фоні препарату контрастно виділяються рожево-малинові клітини бактерій, оточені безбарвними капсулами.

1.4. Фарбування капсул за методом Омелянського

На предметне скло нанести краплю наполовину розведеного водою карболового фуксину Циля. У краплю фарби внести краплю бактеріальної суспензії. Через 2-3 хвилини додати краплю рідкої чорної туші (1:9) чи 10%-ний розчин нігрозину. Краплі ретельно й швидко змішати, щоб вони не висохли, та, користаючись покривним і предметним склом, приготувати мазки по типу мазків крові – підвести покривне скло до краплі суспензії під кутом 45 і пересунути його вперед до кінця предметного скла.

Препарат висушити у повітрі і виконати мікроскопію з об'єктивом 40х чи 90х. У полі зору мікроскопа видно яскраво-малинові клітини бактерій, що оточені безбарвними капсулами на темному фоні туші, тому що туш не проникає в капсулу, а фуксин її не забарвлює.

1.5. Фарбування капсул за методом Антоні

На предметному склі готують мазок досліджуваної культури мікроорганізмів. Мазок висушують у повітрі і фіксують парами формаліну кілька секунд. Для фіксації препарат поміщають у чашку Петрі на обрізки скла мазком униз над краплею формаліну. Фіксований мазок 2-3 хвилини забарвлюють 1%-ним розчином генціанвіолета і промивають 2%-ним розчином сульфату міді. Препарат висушують у повітрі і виконують мікроскопію з імерсією. На світло-бузковому фоні препарату видні фіолетові клітини бактерій, оточені безбарвними капсулами. Найбільш удале фарбування спостерігається по краях мазка.

1.6. Спосіб Міхіна

Мазок готують звичайним способом, офарблюють розчином метиленового синього протягом 2-3 хвилин, підігріваючи до появи пару. Фарбу швидко змивають водою, мазок просушують фільтрувальним папером (розчин метиленового синього краще брати давнього приготування, оскільки, чим довше зберігається цей розчин, тим краще профарбовується препарат). Капсули забарвлюються в ясно-рожевий колір, бактерії – у темно-синій.