Виділення чистих культур за методом Коха

Для одержання ізольованих колоній за методом Коха і виділення з них чистих культур аеробних бактерій роблять посів на поверхню твердого живильного середовища у чашки Петрі з накопичувальної культури:

• Розплавляють стерильне агаризоване сусло в колбі на водяній бані і розливають його в 3-4 стерильні чашки Петрі.

• Мікроорганізми висівають і розподіляють шпателем Дригальского чи петлею, використовуючи техніку виснаженого штриха чи мазка (рис. 2.6) послідовно в декількох чашках Петрі з застиглим твердим агаризованим середовищем:

• Спочатку на поверхню середовища першої чашки, використовуючи петлю, наносять краплю розведення накопичувальної культури й обережно розтирають її стерильним скляним шпателем по всій поверхні.

• Потім цим же шпателем із клітинами мікроорганізмів, що залишилися на ньому, засівають поверхню другої чашки. Далі цим же шпателем проводять вздовж поверхні третьої чашки Петрі.

• Після посіву чашки необхідно перевернути нагору дном і поставити в термостат із температурою, що сприятлива для даного мікроорганізму.

• Інкубують посіви звичайно протягом 2-5 днів (у залежності від швидкості росту конкретних мікроорганізмів).

• Таким чином, після інкубації у перших чашках звичайно спостерігається суцільний ріст мікроорганізмів (суцільний «газон»), а в наступних утворюються ізольовані колонії. У випадку засіву за секторами у перших відбувається суцільний ріст, а уздовж наступних штрихів виростуть відособлені колонії мікроорганізмів, що представляють потомство однієї клітини.

• Ізольовані колонії відсівають петлею в пробірки на поверхню скошеного густого середовища чи в рідке середовище.

• Усі операції з посівів мікроорганізмів виконуються стерильно біля вогню.

Висів із накопичувальної культури мікроорганізмів, що відносяться до факультативних аеробів чи факультативних анаеробів, для одержання ізольованих колоній роблять методом глибинного посіву в пробірки зі стовпчиком стерильного агару. Стерильною голкою беруть чисту культуру з колоній, одночасно виймають пробку, обпалюють край пробірки і, тримаючи її нагору дном, голкою над пальником роблять прокол до дна.

Виділення чистої культури анаеробних бактерій за методом Коха можливо тільки в умовах, що виключають доступ до них вільного кисню. Анаеробні мікроорганізми можна культивувати у звичайних пробірках і чашках Петрі, поміщаючи їх після посіву в анаеростати – вакуумні скляні ексикатори.

Рис. 2.6 - Розсів мікроорганізмів на поверхню твердого середовища:

а – шпатель Дригальського;

б – розсів;

в – ріст мікроорганізмів після розсіву шпателем;

г - ріст мікроорганізмів після розсіву петлею.

Порядок виконання роботи

1. Підготувати скошений агар (косяки) й стовпчики твердого живильного середовища у мікробіологічних пробірках для подальшого культивування та перевірки чистоти культур (МПА, сусло-агар, пептонний агар та середовище Гаузе). Заповнювати середовищем не більш, ніж на 1/3.

• Середовище з агаром нагрівають на киплячій водяній бані до повного його розплавлення. У пробірки середовище наливається шаром, не більш, ніж на 1/3 пробірки. Для цього судину із середовищем беруть у праву руку, а стерильну пробірку, у яку наливають середовище, у ліву. Горло колби проводять через полум'я спиртівки, ватяну пробку після розливу обпалюють. Під час роботи пробку тримають між мізинцем і безіменним пальцем правої руки, після розливу обпалюють

• Для одержання стовпчика з живильним середовищем пробірку залишають для затвердіння середовища у вертикальному положенні, а для одержання скошеної поверхні пробірки із середовищем установлюють у похилому положенні на спеціальну підставку, але так, щоб верхній кінець косяка закінчувався за 3-4 см до пробки. Стовпчики використовують для посіву культури уколом.

• Потрібно стежити за тим, щоб край пробірок чи флаконів не був змочений живильним середовищем, тому що ватно-марлеві пробки можуть приклеїтись до скла під час стерилізації і важко вийматимуться, ускладнюючи тим процес роботи.

2. Підготувати 3 чашки Петрі з твердими пластинками живильного середовища: розлити МПА, пептонний агар, СА, вівсяний агар, середовище Гаузе у чашки Петрі (15-20 мл).

• Стерильне густе живильне середовище розплавляють у колбі на водяній бані й охолоджують до 50-60С.

• Виймають чашки Петрі з папера, у якому вони стерилізувалися, і ставлять їх на рівну горизонтальну поверхню.

• Беруть пробірку чи колбу з охолодженим до 50-60С живильним середовищем, виймають ватяну пробку, обпалюють у полум'ї пальника край судини і тримають його в похилому положенні.

• Відкривають кришку чашки Петрі лівою рукою убік полум'я, а правою рукою наливають середовище в кількості 15-20 мл, злегка рухаючи чашкою для рівномірного розподілу середовища за всією поверхнею дна чашки Петрі.

• Залишають чашку Петрі на столі до повного затвердіння середовища, потім ставлять у термостат на 15-20 хвилин для підсушування.

3. Підготовити до стерилізації 5-6 пробірок з водопровідною водою для розведення суспензій мікроорганізмів.

4. Провести посів накопичувальних культур дріжджів (Saccharomyces cereviceae) і молочнокислих мікроорганізмів (із кефіру), а також оцтовокислих бактерій (Acetobacter aceti) поверхневим способом за методом виснаженого штриха в чашки Петрі із сусло-агаром, аеробних бактерій (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus) на МПА або пептонний агар. Перед посівом виконати мікроскопічний аналіз мікроорганізмів накопичувальних культур. Слідкувати, щоб петля не пошкодила поверхні середовища.

Поверхневий спосіб посіву на щільні середовища в чашки Петрі:

• На тверде середовище наносять петлею краплю посівного матеріалу і потім рівномірно розподіляють його на поверхні, користаючись стерильним шпателем Дригальського. За умови узяття рідини петлею вона повинна затягти петлю тонкою плівкою. Піпеткою користаються в тому випадку, коли матеріал засівають у великій кількості чи визначеному об’ємі.

• Шпатель виймають із папера і беруть у праву руку.

• Відкривають кришку чашки Петрі лівою рукою і вносять у неї шпатель.

• Розмазують краплю посівного матеріалу шпателем обертальними рухами на поверхні агарової пластинки (надавлювати шпателем на тверде середовище не треба, тому що можна йому зашкодити).

• З метою економії середовищ і посуду можна користатися однією чашкою, розділивши її на сектори і послідовно засівати їх штрихом (метод виснаженого штриха). Для цього матеріал беруть петлею і проводять нею ряд паралельних штрихів спочатку на поверхні першого сектора, а потім послідовно засівають всі інші сектори клітинами, що залишилися на петлі. З кожним наступним штрихом відбувається зменшення кількості клітин, що засіваються.

• Переносять шпатель у судину з дезінфікуючим розчином.

5. Для виділення культур і вивчення культуральних властивостей анаеробних культур зробити посів бактеріальних культур накопичувальних культур (Clostridium pasteurianum, Clostridium butiricum) у чашки Петрі із МПА і молочнокислих бактерій (із кефіру) глибинним способом.

Техніка глибинного посіву на тверді середовища в чашки Петрі:

• Відкривають стерильну чашку і поміщають петлею чи піпеткою краплю посівного матеріалу на дно чашки.

• Розплавляють агаризоване живильне середовище у пробірці чи колбі й охолоджують його до 45-50С.

• Обпалюють край пробірки чи колби в полум'ї пальника і виливають середовище (15-20 мл) у чашку Петрі з внесеним посівним матеріалом, дотримуючись правил стерильної роботи.

• Розподіляють рівномірно посівний матеріал у живильному середовищі, для чого обережно круговими рухами переміщають чашку Петрі на поверхні столу.

• Залишають чашку Петрі на столі до повного затвердіння середовища.

• Роблять на чашці напис (число, назва мікроорганізму).

• Усі посіви для вирощування мікроорганізмів поміщають у термостат із температурою, що сприятлива для їхнього росту.

5. Провести пересівання культур бактерій (Clostridium butiricum), вирощених на рідких живильних середовищах в інше рідке стерильне живильне середовище (картопляне середовище).

Техніка пересівання культур мікроорганізмів, вирощених у рідкому середовищі:

• Клітини мікроорганізмів, що виросли в рідкому живильному середовищі відбирають частіше стерильною піпеткою.

• Зі стерильного папера виймають градуйовану стерильну піпетку за верхній кінець, беруть піпетку середнім і великим пальцями правої руки, не торкаючись поверхні тієї частини піпетки, що буде вводитися в судину з рідким середовищем.

• Беруть у ліву руку пробірку (чи колбу) із культурою мікроорганізму, що вирощена в рідкому середовищі, і тримають її у вертикальному положенні, щоб не замочити пробку.

• Відкривають пробку, дотримуючись правил асептики, і вводять піпетку в пробірку.

• Набирають у піпетку суспензію мікроорганізму, закривають пробкою пробірку (чи колбу), вносять визначену кількість суспензії у свіже стерильне живильне середовище, дотримуючись правил стерильності.

• Після використання піпетку поміщають у судину з дезінфікуючим розчином, не торкаючись нею навколишніх предметів (0,5 %-ний водний розчин хлораміну чи 3-5 %-ний водний розчин фенолу).

5. Зробити пересів чистих культур бактерій (Staphylococcus aureus, Micrococcus lisodeikticus) на скошений МПА і мікроскопічних грибів (Streptomyces recifensis, Blakeslea trispora) на скошений СА з пробірки в пробірку за допомогою бактеріологічної петлі.

Техніка посіву мікроорганізмів, що вирощені на твердому середовищі в пробірках, в іншу пробірку із середовищем:

• Запалюють пальник. Посіви проводять над полум'ям пальника, щоб гаряче повітря перешкоджало осадженню мікроорганізмів з навколишнього повітря.

• Беруть у праву руку бактеріологічну петлю, за допомогою якої здійснюють посів (петлю тримають як олівець). Стерилізують бактеріологічну петлю в полум'ї пальника, прожарюючи дріт до червоності, і одночасно обпалюють частину утримувача, що примикає до петлі і буде вводитися в пробірку з культурою мікроорганізму. Упродовж прожарювання петлю тримають у полум'ї майже вертикально, щоб весь дріт був розпечений.

• Беруть у ліву руку дві пробірки – одну зі стерильним середовищем (далі від себе), іншу – із культурою мікроорганізму.

• Не випускаючи бактеріологічної петлі, мізинцем і безіменним пальцем правої руки притискають зовнішні кінці ватяних пробок до долоні і виймають пробки з пробірок. Класти пробки на стіл не можна.

• Злегка обпалюють у полум'ї пальника край відкритих пробірок.

• Прожарену бактеріологічну петлю вводять у пробірку з культурою мікроорганізму. Щоб не зашкодити клітинам, петлю спочатку прохолоджують, доторкаючись до внутрішньої поверхні пробірки чи до живильного середовища, вільного від клітин мікроорганізмів, і тільки після цього відбирають невелику кількість мікробної маси.

• Виймають петлю і вводять її у пробірку зі стерильним живильним середовищем, уникаючи дотику зі стінками пробірки.

• Проводять петлею від дна догори зигзагоподібний чи прямий штрих, злегка торкаючись поверхні агару.

• Обпалюють ватяні пробки і край пробірок одночасно в полум'ї і закривають обидві пробірки.

• Закриту ватяною пробкою пробірку з культурою ставлять у штатив, а витягнутий матеріал використовують для готування препарату чи для пересівання культури у свіже середовище.

• Обпалюють петлю в полум'ї.

• Усі описані маніпуляції варто проводити біля полум'я, за можливістю швидко, щоб не забруднити культуру сторонніми мікроорганізмами.

5. Для вивчення мікрофлори повітря зробити посів із повітря на МПА й СА живильне середовище у чашки Петрі.

Мікробіологічний метод дослідження повітря, що заснований на седиментації, зв'язаний з осіданням бактеріальних клітин під впливом сили ваги на поверхню агару відкритої чашки Петрі. Метод дає представлення в основному про якісний зміст мікроорганізмів. У залежності від поставленої задачі з дослідження мікрофлори повітря може проводитися як визначення загальної бактеріальної зараженості повітря, так і вивчення вмісту санітарно-показових мікроорганізмів, а також наявності патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів. Загальну кількість бактерій, що зустрічаються в повітрі, враховують за ростом колоній мезофільних мікроорганізмів на МПА, проби відбирають на рівні подиху сидячої людини.

Чашки з МПА експонують 5-10-15 хвилин у залежності від передбачуваного бактеріального забруднення. Орієнтовно відповідно до перерахунку за Омелянським на поверхню 100 см² агару осідає за 5 хвилин така кількість бактерій, що міститься в 10 л повітря.

Результати роботи протоколюють. Результати всіх посівів розглянути на наступному занятті.

Петлі, голки обпалюють у полум’ї пальника. Посуд дезінфікують. Результати роботи протоколюють.

Результати всіх посівів розглядають на наступному занятті.