2.4 Определение активности каталазы

Каталаза (КФ 1.11.16) широко распространена в растительных тканях. Она обнаружена во всех аэробно дышащих клетках и у некоторых факультативных анаэробов. Подобно пероксидазе и цитохромоксидазе каталаза относится к Fe-порфириновым ферментам [32].

Сущность каталитического действия каталазы состоит в разложении пероксида водорода с выделением молекулярного кислорода. Реакция с участием каталазы требует двух молекул пероксида водорода, из которых одна действует как донор, а другая как акцептор электронов.

Чане представил следующий механизм каталитической реакции:

2Н₂О₂ → 2Н₂О + О₂

FeOH + НООН → FeOOH + Н₂О

FeOOH + НООН → FeOH + Н₂О + О₂

Пероксид водорода, образующийся в обменных реакциях, в известных концентрациях для клетки токсичен, в связи с чем нельзя недооценивать роль каталазы, активирующей процесс разложения пероксида водорода с образованием воды и неактивного кислорода. Известно, что каталаза проявляет каталитическую функцию независимо от присутствия пероксидазы.

Для определения активности каталазы использовали модифицированный метод, основанный на определении количества Н₂О₂, не разложившегося после инкубации его с каталазой путем спектрофотометрической регистрации окрашенного продукта реакции взаимодействия пероксида водорода с молибдатом аммония.

В опытной пробе к 1 мл 0,03% пероксида водорода добавляли 0,1 мл частично очищенного цитозоля (гомогенат ткани 1:10, приготовленный на 0,1 М трис-HCl буфере (рН=7,4), центрифугировали 30 минут (3000 g) при 4°С и разбавить до разведения 1:500 (0,1 мл + 4,9 мл буфера).

В контрольной пробе вместо пероксида водорода использовали дистиллированную воду. В “холостой” пробе к Н₂О₂ вместо биологического материала добавляли 0,1 мл Н₂О. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре и затем добавляли 0,5 мл 4% молибдата аммония. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 412 нм.

Активность каталазы рассчитывали по формуле:

где Ехол, Еоп – оптическая плотность «холостой» и опытной пробы;

V – конечный объем реакционной смеси, мл;

ε – коэффициент молярной экстинкции, 22200 см^-1 × М^-1;

t – время инкубации пробы, мин;

l – длина кюветы, см;

m_ткани – масса ткани в реакционной смеси, мг;

Активность фермента выражали в мкмоль/ г ткани.

2.5 Количественное определение суммы фенольных соединений

К 0,2 мл полученного извлечения прибавляли 7,7 мл воды очищенной, 0,1 мл реактива Фолина-Чиокальто и 2 мл 10% раствора карбоната натрия, все тщательно перемешивали и вьдерживали в темном месте. Через 15 минут измеряли оптическую плотность полученного раствора на фотоколориметре при длине волны 720 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служила вода очищенная.

Содержание суммы фенольных соединений в процентах (X) в пересчете на галловую кислоту в абсолютно сухом сырье вычисляли по формуле:

А – оптическая плотность исследуемого раствора;

V1 – объем экстракта, мл;

V2 – объем раствора для спектрофотометрирования, мл;

V3 – объем экстракта, взятый для определения, мл;

- удельный показатель поглощения галловой кислоты в комплексе с реактивом Фолина-Чиокальто при длине волны 720 нм, равный 90;

m – масса сырья в граммах;

W – потеря в массе при высушивании сырья в процентах.