Методы культивирования вирусов

Для культивирования вирусов в лаб.усл.используются следующие живые объекты:

I. Культуры кл.

однослойные культуры кл, которые можно разделить на первичные (первично трипсинизированные), полуперевиваемые (диплоидные), перевиваемые, трансфецированные.

По происхождению : эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу —фибробластные, эпителиальные.

Первичные культуры кл.— это кл. какой-либо ткани, способные культивироваться в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности в спец. питательной среде, но не способные к длительному размножению. Срок жизни таких культур ограничен. Их получают из ткани после механич. измельчения, обработки протеолитическими ф-тами и стандартизации кол-ва кл.

Полуперевиваемые (диплоидные)— кл.одного генотипа, способные in vitro выдерживать до 50100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона ч-ка используются для диагностики вирусных инф. и при пр-стве вирусных вакцин.

Перевиваемые кл.линии х-ся бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные кл.культуры (СОЦ — из сердца обезьяны циномольгус, ПЭС — из почек эмбриона свиньи), отдельные кл. которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению в кл. таких свойств, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.

Др. источник перевиваемых кл. линий — злокачественные новообразования. В этом случае трансформация кл. происходит in vivo. Применяются следующие линии перевиваемых кл.: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Hep-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака легкого в костный мозг; RH — из опухоли почки ч-ка.

Трансфецированные культуры кл. Разработаны экспериментальные линии культур кл. методом трансфекции (переноса) генов вирусов, контролирующих биосинтез поверхностных АГ. Такие культуры кл. экспрессируют поверхностный б.опред. вируса (HBs-антиген, gp120) на мембране. Такие культуры используются для изучения иммунологических мех-мов патогенеза вирусных инф., разработки химиотерапевтических и иммунобиологических препаратов.

питательные среды по назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В ростовых питательных средах должно содержаться больше питательных в-в, обеспечивающих активное размножение кл. и формирование монослоя. Поддерживающие среды обеспечивают переживание кл.в уже сформированном монослое в период размножения в них вирусов.Все питательные среды конструируются на основе сбалансированного солевого р-ра; неотъемлемый компонент большинства ростовых сред — сыворотка крови животных, без наличия 510% которой размножение кл. и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит. С целью предотвращения возможного роста м\о в питат. среды вносят, а\б.

Выделение вирусов в культурах клеток и методы их индикации

При выделении вирусов из различных инф. материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые, смывы из органов) применяют культуры кл, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры с хорошо развитым монослоем кл. Перед заражением питат. среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,10,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного а\б для уничтожения бактерий и грибов. После 3060 мин. контакта вируса с монослоем кл.удаляют избыток материала, в культуру вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

Индикатором наличия вируса в зараженных культурах служит:

1. развитие специфической дегенерации клеток - ЦПД: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток (симпластов); развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;

2. обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток;

3. положительная реакция гамагглютинации (РГА) или гемадсорбции (РГАдс);

4. феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного (фон — розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара.

5. при отсутствии ЦПД, ГА или ГАдс. можно использовать реакцию интерференции: исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.