10. Методы изучения структуры белка. Физико-химические свойства белков. Методы оценки размеров и формы белковых молекул. Денатурация и ренатурация белка.

БЕЛКИ, высокомол. природные полимеры, построенные из остатков аминокислот, соединенных амидной (пептидной) связью —СО—NH—. Каждый БЕЛКИ характеризуется специфический аминокислотной последовательностью и индивидуальной пространств, структурой (конформацией). На долю БЕЛКИ приходится не менее 50% сухой массы органическое соединение животной клетки. Функционирование БЕЛКИ лежит в основе важнейших процессов жизнедеятельности организма. Обмен веществ (пищеварение, дыхание и др.), мышечное сокращение, нервная проводимость и жизнь клетки в целом неразрывно связаны с активностью ферментов - высокоспецифический катализаторов биохимический реакций, являющихся белками. Основу костной и соединительной тканей, шерсти, роговых образований составляют структурные БЕЛКИ (см., например, Коллаген). Они же формируют остов клеточных органелл (митохондрий, мембран и др.).

Свойства. Физ.-хим. свойства Б. определяются их высокомол. природой, компактностью укладки полипептидных цепей и взаимным расположением остатков аминокислот. Мол. масса варьирует от 5 тыс. до 1 млн., а константы седиментации - от 1 до 20 (и выше). Средний уд. объем белковых молекул - 0,70-0,75 см3/г, а константы диффузии - 106-108 см2/с. Максимум поглощения Б. в УФ-области спектра, обусловленный наличием ароматич. аминокислот, находится вблизи 280 им. Возбуждение электронов атома азота пептидной группы вызывает резкое увеличение поглощения при 185-240 нм. В ИК-области спектра Б. поглощают за счет СО- и NH-rpyпп при 1600 и 3100-3300 см-1.

В растворах Б. амфотерны. Изоэлектрич. точки Б. могут иметь значения от < 1,0 (у пепсина) до 10,6 (у цитохрома с) и выше. Боковые группы аминокислотных остатков способны вступать во многие реакции. Б. дают ряд цветных реакций, обусловленных наличием определенных аминокислотных остатков или хим. группировок. К важнейшим из них относятся: биуретовая реакция (пептидные связи), ксантопротеиновая реакция (ароматич. ядра остатков тирозина, триптофана, фенилаланина), Адамкевича реакция (индольное кольцо триптофана), Мил лона реакция (фенольный радикал тирозина), Паули реакция (имидазольное кольцо гистидина), Сакагучи реакция (гуанидиновая группа аргинина) и нингидриновая реакция (аминогруппа).

Выделение. Один из первых этапов выделения Б. - получение соответствующих органелл (рибосом, митохондрий, ядер, цитоплазматич. мембраны) с помощью дифференциального центрифугирования. Далее Б. переводят в растворимое состояние путем экстракции буферными растворами солей и детергентов, иногда - неполярными р-рителями. Затем применяют фракционное осаждение неорг. солями [обычно (NH4)2SO4], этанолом, ацетоном или путем изменения рН, ионной силы, температуры. Для предотвращения денатурации работу проводят при пониж. температуре (ок. 4°С); с целью исключения протеолиза используют ингибиторы протеаз, некоторые Б. стабилизируют полиолами, например глицерином. Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным для отдельных Б. или группы гомологичных Б. наиб. распространенные методы разделения-гель-проникающая хроматография, ионообменная и адсорбц. хроматография; эффективные методы-жидкостная хроматография высокого разрешения и аффинная хроматография. Критерий чистоты Б. - гомогенность при электрофорезе, хроматографии и ультрацентрифугировании. Одноцепо-чечный Б. должен быть гомогенным при N- и С-концевом анализе (см. ниже). Примесь сопутствующих ферментов определяют с помощью специфич. субстратов; высокую чувствительность имеют иммунохим. методы (обычно до 10-3 мкг/мл примесного антигена).

Денатурация белков (от лат. de- — приставка, означающая отделение, удаление и лат. nature — природа; не путать с лат. denaturatus — лишенный природных свойств) — термин биологической химии, означающий потерю белками их естественных свойств (растворимости, гидрофильности и др.) вследствие нарушения пространственной структуры их молекул.Процесс денатурации отдельной белковой молекулы, приводящий к распаду её «жёсткой» трёхмерной структуры, иногда называют плавлением молекулы. Механизмы денатурации Практически любое заметное изменение внешних условий, например, нагревание или обработка белка кислотой приводит к последовательному нарушению четвертичной, третичной и вторичной структур белка. Обычно денатурация вызывается повышением температуры, действием сильных кислот и щелочей, солей тяжелых металлов, некоторых растворителей (спирт), радиации и др.Денатурация часто приводит к тому, что в коллоидном растворе белковых молекул происходит процесс агрегации частиц белка в более крупные. Визуально это выглядит, например, как образование «белка» при жарке яиц.

Ренатурация (высаливание) — процесс, обратный денатурации, при котором белки возвращают свою природную структуру. Нужно отметить, что не все белки способны ренатурировать; у большинства белков денатурация необратима.Методы выделения и анализа белковПрепараты высокоочищенных белков находят разнообразное применение в научных исследованиях, медицине и биотехнологии. Так как многие белки, и в особенности глобулярные, высоколабильны (см. с. 80), выделение проводят с помощью предельно мягких методов и при пониженной температуре (0-5°С). К таким методам относится ионообменная хроматография, которая обсуждалась на с. 68. Другие методы выделения белков представлены в этом разделе.A. ВысаливаниеРастворимость белков сильно зависит от концентрации солей (от ионной силы). В дистиллированной воде белки чаще всего растворяются плохо, однако их растворимость возрастает по мере увеличения ионной силы. При этом все большее количество гидратированных неорганических ионов (светло-синие кружочки) связывается с поверхностью белка и тем самым уменьшается степень его агрегации (засаливание). При высокой ионной силе молекулы белков лишаются гидратирующих оболочек, что приводит к агрегации и выпадению белка в осадок (высаливание). Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей, например (NН₄)₂SО₄, разделить (фракционировать) смесь белков.Б. ДиализДля отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе.B. Гель-фильтрацияГель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет разделять белки по величине и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов (1а). Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков (1б) вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля (помечены красным цветом), будут перемещаться с высокой скоростью. Средние (зеленого цвета) и небольшие белки (синего цвета) будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля (1в). На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций (2). Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной массы (3).Г. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрияВ настоящее время электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) [ДСН-ПААГ-электрофорез (SDS-PAGE)] является общепринятым методом определения гомогенности белковых препаратов. Метод основан на свойстве заряженных частиц (молекул) перемещаться под действием электрического поля (см. с. 270). Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда. Поэтому предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы. Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфа-том натрия [ДСН (SDS)] (C₁₂H₂₅OSO₃Na), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами (см. с. 34). Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют. Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают отрицательный заряд. Для полной денатурации в среду добавляют тиолы, которые расщепляют дисульфидные мостики (1).Электрофорез проводят в тонком слое полиакриламида (2). После завершения электрофореза, зоны белков выявляют c помощью красителя, В качестве примера на схеме 3 приведена электрофореграмма трех препаратов: клеточного экстракта, содержащего сотни белков (а); выделенного из экстракта гомогенного белка (б); контрольной смеси белков с известными молекулярными массами (в).

11. Принципы классификации и номенклатуры белков. Классификация белков: по форме молекулы, составу, структуре и функциям. Глобулярные и фибриллярные белки. Простые и сложные белки. Функциональная классификация белков

. Белки - природные высокомолекулярные органические соединения, построенные из остатков 20 аминокислот, которые соединены пептидными связями в полипептидные цепи. В процессах жизнедеятельности всех организмов белки выполняют структурную, регуляторную, каталитическую, защитную, транспортную, энергетическую и другие функции. Белки - основа кожи, шерсти, шелка и других натуральных материалов, важнейшие компоненты пищи человека и корма животных. Названию белки, наиболее принятому в отечественной литературе, соответствует термин протеины (от греч. proteios — первый).

В настоящее время еще не разработана стройная система номенклатуры и классификации белков. Традиционная классификация белков по группам, основанная, скорее, на случайных показателях (физико-химические свойства, форма молекул, локализация и происхождение, аминокислотный состав), уже не отвечает полностью возросшему уровню знаний о их структуре и функциях. Из огромного количества природных белков структура и функции расшифрованы для относительно небольшого числа (не более нескольких сотен), и поэтому структура и функции белков пока не могут служить основой для их рациональной классификации. Пожалуй, только для одной группы белков, обладающих способностью катализиро* Установлена четвертичная структура ряда иммуноглобулинов, состоящих из легких и тяжелых полипептидных цепей, соединенных в отличие от других олигомерных белков ди сульфидными связями.I По строению:1 Простые (протеины) состоят только из остатков аминокислот.2 Сложные (протеиды) при гидролизе образуют аминокислоты и другие соединения:а) нуклеопротеиды: белок + нуклеиновая кислота, растворимы в щелочах, не растворимы в кислотах;б) фосфопротеиды: белок + остаток фосфорной кислоты. Денатурируют при действии кислот (казеин молока);в) глюкопротеиды: белок + углевод. Не растворимы в воде, растворимы в щелочах, нейтральны (слизь);г) хромопротеиды: белок + красящее вещество (гемоглобин).II По растворимости1 Склеропротеины – не растворимы в воде.2 Альбумины – растворимы в воде.3 Глобулины – растворимы в растворах солей.4 Глутемины – растворимы в кислотах и щелочах.5 Глиадины – растворимы в 70 %-ном этаноле.6 Гистоны и протамины – растворимы в щелочах.III По форме1 Глобулярные имеют сложную конформацию: полипептидные цепи свернуты в компактные глобулы.2 Фибриллярные имеют вытянутую, нитевидную форму и состоят из нескольких полипептидных цепей.

По Функции белков1 Структурные (коллаген, фиброин, кератин и т.п.).

Входят в состав мембран клеток и отличаются высокой гидрофобностью. Составляют остов многих тканей и органов, определяют их механические свойства: коллаген соединительных тканей, костей, суставов; эластин связок, α-кератин кожи, волос, ногтей, рогов, перьев, склеротин – наружного скелета насекомых, фиброин шелка. К этой группе можно отнести белковые вещества клеточных стенок бактерий, оболочек вирусов, мембранные и рибосомальные белки.

2 Двигательные (сократительные – актин, миозин).Наиболее известны белки сократительного аппарата мышц – актин и миозин. Их разновидностью является тубулин, входящий в состав микротрубочек, обеспечивающих перемещение ресничек и жгутиков клетки.

3 Каталитические (ферментативные – энзимы).Ежесекундно в клетке протекает множество ферментативных реакций. В настоящее время выделено около 2000 ферментов клетки. Особое значение имеют РНК- и ДНК-полимеразы, липазы и т.п. Ферменты могут быть построены из одной полипептидной цепи, нескольких цепей или даже образовывать комплексы. Ферменты увеличивают скорость реакции в миллионы и миллиарды раз. Например, уреаза при рН 8,0 и 20 °С ускоряет гидролиз мочевины в 1014 раз.

4 Транспортные (гемоглобин, миоглобин, цитохром и др.).Ряд белков выполняет функции переноса веществ из одного компартмента клетки в другой или между органами целого организма. Например, гемоглобин переносит кислород от легких к тканям, а углекислый газ от тканей к легким. В крови локализованы специальные транспортные белки – альбумины, переносящие различные экзогенные и эндогенные вещества. Имеются также специальные белки – пермеазы, переносящие различные вещества через биологические мембраны.

5 Регуляторные (гормоны-гистоны, репрессоры).В организме существует специальный класс белков, выполняющих регуляторные функции. В первую очередь к ним относятся гормоны белково-пептидной природы. Эти белки играют основную роль в регуляции клеточной и физиологической активности. Например, гормон инсулин регулируют потребление клетками глюкозы, кальцитонин – содержание кальция в крови и костной ткани и т.п.

6 Защитные (антитела и иммуноглобулины).Защитные белки включают вещества, которые помогают организму преодолевать патологические состояния или бороться с возбудителями заболеваний. Антитела и иммуноглобулины синтезируются в костном мозге и предохраняют организм от чужеродных бактерий. Они обладают уникальным свойством распознавать чужеродные бактерии, вирусы и белки, связываться с ними и нейтрализовать. Сюда относятся антигены тканевой совместимости, антивирусные реагенты – интерферон, факторы некроза опухолей, а также фибриноген, тромбин и фибрин, предохраняющие организм от потери крови (обеспечивают свертываемость).

7 Рецепторные (родопсин, холинорецептор и т.п.).Играют важную роль при передаче нервного или гормонального сигнала в клетку или ее некоторые компартменты. Рецепторы локализованы в мембранах, и механизмы передачи информации связаны в основном с изменениями конформации белка, поглощением или выделением энергии и т.п.

8 Запасные и питательные (казин молока, яичный альбумин и т.п.).Ряд белков используется клетками в качестве резервного, питательного материала. К ним относятся проламины и глютелины – белки растений, преимущественно зерновых, овальбумин – питательный белок птичьих яиц.

9 Токсические (токсины ботулинический, дифтерийный).Представлены ядами змей, скорпионов, пчел. Они характеризуются относительно низкой молярной массой. Токсины растений и микроорганизмов – дифтерийный и холерный токсины, рицин, абрин и т.п.

10 Антибиотики (актиноксантин, неокарциностатин и т.п.)

12. Характеристика простых и сложных белков. Характеристика классов сложных белков: нуклеопротеиды, липопротеиды, гликопротеиды, фосфопротеиды, хромопротеиды, металлопротеиды, флавопротеиды.

Белки - природные высокомолекулярные органические соединения, построенные из остатков 20 аминокислот, которые соединены пептидными связями в полипептидные цепи. В процессах жизнедеятельности всех организмов белки выполняют структурную, регуляторную, каталитическую, защитную, транспортную, энергетическую и другие функции. Белки - основа кожи, шерсти, шелка и других натуральных материалов, важнейшие компоненты пищи человека и корма животных. Названию белки, наиболее принятому в отечественной литературе, соответствует термин протеины (от греч. proteios — первый).По строению:1 Простые (протеины) состоят только из остатков аминокислот.2 Сложные (протеиды) при гидролизе образуют аминокислоты и другие соединения:а) нуклеопротеиды: белок + нуклеиновая кислота, растворимы в щелочах, не растворимы в кислотах;б) фосфопротеиды: белок + остаток фосфорной кислоты. Денатурируют при действии кислот (казеин молока);в) глюкопротеиды: белок + углевод. Не растворимы в воде, растворимы в щелочах, нейтральны (слизь);г) хромопротеиды: белок + красящее вещество (гемоглобин).

Нуклеопротеиды, широко распространённые в природе комплексы нуклеиновых кислот с белками. В зависимости от характера входящей в состав Н. нуклеиновой кислоты различают дезоксирибонуклеопротеиды (ДНП) и рибонуклеопротеиды (РНП). ДНП содержатся в ядрах всех клеток (составляют основу ядерного вещества — хроматина) и в головках сперматозоидов. Белковым компонентом ДНП служат преимущественно белки основного характера — гистоны; в головках сперматозоидов некоторых животных (главным образом птиц и рыб) присутствуют белки с более мелкими молекулами — протамины. Гистоны и протамины при нейтральных рН несут большой положительный заряд, что обеспечивает возможность сильного электростатического взаимодействия с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Полагают, что белки в ДНП располагаются в желобках двойной спирали ДНК, стабилизируя её структуру и выполняя определённые биологической функции (регуляция матричной активности ДНК). Из РНП состоят многие вирусы, информосомы, рибосомы.Липопротеиды (от греч. lípos — жир и протеиды), липопротеины, комплексы белков и липидов. Представлены в растительных и животных организмах в составе всех биологических мембран, пластинчатых структур (в миелиновой оболочке нервов, в хлоропластах растений, в рецепторных клетках сетчатки глаза) и в свободном виде в плазме крови (откуда впервые выделены в 1929). Л. различаются по химическому строению и соотношению липидных и белковых компонентов. По скорости оседания при центрифугировании Л. подразделяют на 4 главных класса: 1) Л. высокой плотности (52% белка и 48% липидов, в основном фосфолипидов); 2) Л. низкой плотности (21% белка и 79% липидов, главным образом холестерина); очень низкой плотности (9% белка и 91% липидов, в основном триглицеридов); 4) хиломикроны (1% белка и 99% триглицеридов). Полагают, что структура Л. мицеллярная (белок связан с липид-холестериновым комплексом за счёт гидрофобного взаимодействия) либо аналогична молекулярным соединениям белков с липидами (молекулы фосфолипидов включены в изгибы полипептидных цепей белковых субъединиц). Исследования Л. осложнены неустойчивостью комплексов липид — белок и трудностью их выделения в природной форме.Гликопротеиды, сложные белки, содержащие углеводы. Молярная масса от нескольких десятков тыс. до нескольких миллионов. Присутствуют почти во всех тканях и жидкостях животных (включая человека), в тканях растений и в микроорганизмах. К Г. относятся муцины (встречаются в секретах всех слизистых желёз — в слюне, желудочном соке, в спинномозговой и семенной жидкостях) и мукоиды (входят в состав опорных тканей — костей, хряща, связок, стекловидного тела глаза, яичного белка). К Г. относятся многие белки плазмы крови (церулоплазмин, орозомукоид, трансферин, протромбин), групповые вещества крови, иммуноглобулины, некоторые ферменты (панкреатическая рибонуклеаза Б, така-амилаза), гормоны (тиреотропин и фолликулостимулирующий гормон). Содержание углеводов в Г. варьирует от долей процента до 80%; их полисахаридная часть может содержать глюкозамин, галактозамин, галактозу, маннозу и др. углеводы. По аминокислотному составу все известные Г. делят на две группы: 1) содержащие обычный набор аминокислот и небольшое количество углеводов (3—40%); 2) имеющие специфический набор аминокислот с преобладанием серина и треонина и высокое содержание углеводов (60—80%).Фосфопротеиды, фосфопротеины, сложные белки, в состав которых входит фосфорильная группа, присоединённая к аминокислотным остаткам полипептидной цепи белка. Обычно фосфорильная группа (–PO₃^2-) присоединена к молекулам Ф. через остатки аминокислот серина или треонина; в митохондриях животных тканей обнаружены Ф., в которых фосфорильная группа присоединена к белку через имидазольное кольцо гистидина. Перенос фосфорильного остатка на белок катализируется ферментом протеинкиназой из группы фосфотрансфераз, донором фосфата при этом служит молекула аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Под действием щёлочи происходит неферментативное отщепление фосфорильной группы; к влиянию кислот Ф. сравнительно устойчивы. К Ф. относятся: казеин – один из основных белков молока, овальбумин и вителлин – белки куриного яйца, фосфорилированные модификации гистонов, ферменты РНК-полимеразы, некоторые фосфотрансферазы, фосфатазы и др. Ф. широко распространены в живых организмах, участвуя в обмене веществ, регуляции ядерной активности клетки, транспорте ионов и окислительных процессах в митохондриях.Хромопротеиды (хромо... и протеиды), сложные белки, содержащие окрашенные простетические (небелковые) группы. Наиболее обширную группу Х. составляют железосодержащие белки гемопротеиды, к которым относятся цитохромы (переносчики электронов в процессах клеточного дыхания, при фотосинтезе, в системах гидроксилирования), некоторые ферменты (каталаза, пероксидаза), дыхательные пигменты (гемоглобин, миоглобин). У многих беспозвоночных животных функцию связывания кислорода выполняют гемоглобиноподобные белки эритрокруорины, а в крови некоторых многощетинковых червей — хлорокруорины. Вторую группу Х. составляют дыхательные пигменты крови беспозвоночных — гемеритрины (содержат негемовое железо) и гемоцианины (содержат медь). Третью группу Х. составляют ферменты, простетическая группа которых представлена рибофлавином, — флавопротеиды (переносчики электронов; играют важную роль в окислительно-восстановительных реакциях во всех животных клетках). К Х. относится и зрительный пурпур (родопсин) сетчатки глаза, содержащий в качестве хромофорной группы 11-цис-ретиналь. Термин «Х.» выходит из употребления и всё чаще применяется главным образом по отношению к дыхательным пигментам крови.Металлопротеиды, класс сложных белков представляют комплексы белков с ионами металлов. Связь между белком и металлом (Fe, Cu, Zn, Mg, V, Mo и др.), как правило, непрочна, однако удаление металла (например, разбавленными неорганическими кислотами приводит к нарушению строения и функциональных свойств М. Распространены в живой природе и выполняют важные биологические функции: транспорт кислорода у беспозвоночных (гемэритрин, гемоцианин), депо и транспорт железа (ферритин, трансферрин), депо и транспорт меди (церулоплазмин) и др. К М. относятся многие ферменты (некоторые цептидазы, тирозиназа, оксидаза аспарагиновой кислоты и др.).Флавопротеиды, флавиновые ферменты, жёлтые ферменты, сложные белки-ферменты, простетической группой (небелковым компонентом) которых служат производные рибофлавина (витамина В2) – флавинадениндинуклеотид (ФАД) или флавинмононуклеотид (ФМН). Впервые обнаружены нем. биохимиком О. Варбургом в 1932. В состав простетической группы многие Ф. наряду с флавиннуклеотидами входят комплексно связанные с ними металлы (Fe, Cu, Mo), соединения серы и т.д. Большинство Ф. в окисленном состоянии окрашено в жёлтый цвет и имеет характерные полосы поглощения в области 350–380 нм и 450–460 нм; в восстановленном состоянии – бесцветны. Ф. относятся к классу оксидоредуктаз и катализируют важные окислительно-восстановительные реакции в живых организмах при непосредственном участии ФАД, реже – ФМН. Специфичность (избирательность) и эффективность действия Ф. определяются природой их белковых компонентов (апоферментов), которые ещё недостаточно изучены. Многие Ф. ассоциированы с клеточными мембранами, образуя прочные комплексы с входящими в их состав липидами. Основная функция Ф. – окисление восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) в цепи переноса электронов (см. Окислительное фосфорилирование). Ф. способны также непосредственно окислять различные субстраты, отщепляя от них атомы водорода, которые переносятся затем на кислород либо сразу (например, ксантиноксидаза), либо через цепь переноса электронов (например, сукцинатдегидрогеназа). Ф. широко распространены в природе и участвуют в катаболизме основных классов органических соединений в клетках животных, растений и микроорганизмов.