10. Электрофорез

Электрофорез – метод разделения веществ, основанный на различии в подвижности заряженных молекул и ионов в электрическом поле. Скорость, с которой заряженная частица (молекула или ион) движется в электрическом поле, прямо пропорциональна электрической силе, действующей на единицу заряда этой частицы, и обратно пропорциональна силе, возникающей в результате деформации ионной сферы, окружающей движущуюся частицу. Ионная сфера частицы состоит из противоположных по знаку ионов веществ, составляющих буферный раствор. Первая из этих сил оценивается приблизительно по напряженности поля, которая вычисляется по формуле

G = , (10.1)

где U – напряжение на концах электрофореграммы, В; l – длина электрофореграммы, см.

Для количественной оценки замедляющей силы пользуются функцией ионной силы

i = 0,5  (C_n Z ), (10.2)

где п – количество типов ионов в растворе; С_п – концентрация п-го иона в растворе; Z_п – заряд п-го иона.

Как видно из уравнения, ионная сила не зависит от химической природы электролита.

Свободный заряд молекул белка в растворе обуславливается ионизацией как основных, так и кислотных групп: карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот, имидазольной группы гистидина, ε-ами-ногруппы лизина, гуадиновой группы арганина и т. п. Величина и знак заряда белковой молекулы зависят от соотношения кислотных и основных групп в молекуле белка, рН и ионной силы окружающего раствора.

С помощью электрофореза можно выделять отдельные фракции белков и выяснять, какие небелковые соединения связаны с этими фракциями, а также изучать изменение каждой фракции в процессе влаготепловой обработки семян.

Из многочисленных методов электрофореза, разработанных в настоящее время, в лабораторной практике получил распространение метод электрофореза на бумаге. Метод позволяет работать с небольшим количеством веществ и фиксировать отдельные фракции на отдельных участках электрофореграммы. Ценность метода для разделения белковых смесей в значительной мере снижается из-за адсорбции белковых веществ бумагой. Это обстоятельство уменьшает чувствительность электрофореза на бумаге и затрудняет количественный анализ белковых фракций.

Адсорбцию белков на бумаге можно уменьшить путем подбора таких условий разгонки, при которых достигается максимальное разделение отдельных фракций белков при минимальном смещении их относительно линий старта. При проведении электрофореза существенное влияние на движение молекул белка оказывает электроосмотический ток жидкости в бумаге, а также ток жидкости, возникающий при испарении ее с поверхности бумаги. Эти явления играют значительную роль при проведении электрофореза при высоких температурах и высокой напряженности электрического поля.

Приборы для электрофореза на бумаге. Известно большое количество различных приборов для электрофореза. Однако каждый их них состоит из двух основных частей – источника постоянного тока и электрофоретической камеры. Источник постоянного тока позволяет получать на выходе напряжение от 200 до 1000 В при силе тока от 5 до 50 мА.

Электрофоретическая камера состоит из стеклянной ванны с пришлифованной к ней крышкой. В ванну помещены две свободно вынимающиеся электродные кюветы, каждая из которых разделена продольной перегородкой на два отделения. В торцевые части кювет опущены угольные электроды, укрепленные на съемных пластинах. Электрический ток между отдельными частями кюветы проходит через перекинутую из одной части в другую полоску фильтровальной бумаги. В ванне находится также рамка, на которую укладывают электрофореграмму. Ванна установлена на деревянной подставке, снабженной электроблокирующим устройством, уровнем и установочными винтами.

В комплект прибора входит также денситометр, автоматически запи-сывающий кривую распределения интенсивности окрашенных белковых фракций по длине электрофореграммы. Денситометр состоит из источника света, механического устройства, позволяющего перемещать электрофореграмму перед щелью камеры. В камере находится фотосопротивление, соединенное с устройством для записи кривой интенсивности освещения на индикаторную бумагу.

Подготовка камеры для электрофореза. Камеру прибора устанавливают в горизонтальное положение с помощью установочных винтов, снимают крышку. Из камеры вынимают рамку для бумажных полос и пластинки с электродами. Электродные кюветы наполняют буферным раствором точно до одинакового уровня, оба отделения каждой кюветы соединяют полоской фильтровальной бумаги и погружают в раствор электроды. На полоски хроматографической бумаги, предварительно смоченные в буферном растворе, наносят раствор белков и располагают их параллельно друг другу (не более пяти). Полоски располагают на рамке так, чтобы они были равномерно натянуты. Рамку помещают в камеру, и концы полосок погружают в буферный раствор, налитый во внутренние отделения электродных кювет. Затем прибор закрывают крышкой, включают электрический ток и устанавливают необходимый режим разгонки (напряженность, силу тока).

Приготовление белкового экстракта. Экстракцию белков из исследуемого материала проводят при условиях, исключающих их денатурацию. Для этого извлечение белков лучше производить при относительно низкой температуре (около +4 °C). Можно экстрагировать белки и при комнатной температуре, но в течение непродолжительного времени. Для экстракции белков рекомендуется применять растворы нейтральных солей или забуференные растворы при рН около 7.

Приготовление буферных растворов. При подборе буферного раствора необходимо учитывать значение величины рН раствора. При низких значениях рН (около 3) или при значениях рН около 10 белки могут терять нативные свойства, что приводит к искажению электрофоретической картины.

Для разделения белков семян некоторых масличных культур можно рекомендовать следующие буферные растворы: для белков семян сои – фосфатный буфер рН 7,6 (1,18 г КН₂РО₄ и 10,33 г Nа₂НРО₄ · 2Н₂О на 1 л дистиллированной воды); для белков семян хлопчатника – боратный буфер рН 8,8 (8,324 г борной кислоты и 6,235 г буры Nа₂В₄О₇ · 10Н₂О на 1 л дистиллированной воды); для белков семян подсолнечника – боратный буфер рН 9,0 (10,79 г борной кислоты и 3,528 г буры на 1 л дистиллированной воды).

Соответствующие навески солей и кислоты растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды при постоянном перемешивании в мерной колбе на 1 л, затем объем раствора доводят водой до метки.

Выбор бумаги и нанесение белковой вытяжки. Электрофорез проводят на хроматографической бумаге небольшой толщины, так как адсорбция белков сильно возрастает при использовании плотных сортов бумаги.

Для разделения белковых веществ масличных семян удобно пользоваться хроматографической бумагой марки «М» или «Б». Для получения воспроизводимых результатов в каждой серии опытов следует применять бумагу одного сорта. Из хроматографической бумаги вырезают бумажные полоски размером 4  40 см и отмечают на них простым карандашом линию старта. Для разделения белков сои линию старта располагают в 10 см от анодного конца полоски; для белков семян хлопчатника – в 10 см от катодного конца полоски; для белков семян подсолнечника –по середине полоски.

На каждую полоску наносят от 0,01 до 0,06 мл недиализованной белковой вытяжки ( количество белка в наносимом объеме не должно превышать 20 мг). Белковую вытяжку наносят в виде полосы (весь объем наносимой вытяжки должен распределяться на 1,5 см²), перемещая микропипетку взад-вперед по бумажной полосе в поперечном направлении и не доводя на 2 мм до каждого края. Исследуемый раствор необходимо наносить равномерно и без повреждения бумаги пипеткой. Бумагу с нанесенной на нее белковой вытяжкой смачивают в буферном растворе, оставляя несмоченными небольшие участки около полосы белковой вытяжки. Избыток буферного раствора удаляют стеклянной палочкой. Подготовленную таким образом бумагу укладывают на рамку камеры.

Проведение электрофореза. Электрофорез проводят при оптимальных для каждого вида белковых веществ условиях разделения: для белков семян сои – при напряженности 6 В/см и силе тока 12…17 мА; для белков семян хлопчатника – при напряженности 4 В/см и силе тока 4,5 мА; для семян подсолнечника – при напряженности 6 В/см и силе тока 3 мА. Хорошее разделение при указанных условиях происходит за 20 ч при комнатной температуре.

Фиксация и окраска электрофореграмм. Перед окрашиванием электрофореграммы подсушивают в сушильном шкафу при 10…110 °С в течение 5 мин. Для окрашивания белков используют бромфеноловый синий (0,05 %-й раствор бромфенолового синего в 2 %-м растворе уксусной кислоты, содержащем 1 % сулемы). Электрофореграммы погружают в ванну с раствором красителя на 5…10 мин, затем удаляют избыток красителя промыванием электрофореграмм в 2 %-м растворе уксусной кислоты (три–четыре раза по 2…3 мин). Более продолжительное промывание приводит к вымыванию бромфенолового синего из белковых фракций, особенно из фракций с низким содержанием белков. Отмытые электрофореграммы подсушивают при 110 °С в течение 3…4 мин и обрабатывают парами аммиака. При этом белковые фракции окрашиваются в синий цвет.

Анализ фракций. Содержание белка в отдельных фракциях определя-ют по количеству сорбированного в них красителя, которое прямо пропорционально количеству белка, содержащегося в данной фракции. Содержание красителя в отдельных фракциях обычно определяют методом элюирования или прямым фотометрированием с помощью денситометра. В обоих случаях для количественной оценки пригодны электрофореграммы, на которых отдельные фракции прямолинейны и параллельны друг другу.

Для элюирования электрофореграмму разрезают на поперечные поло-ски шириной 3…5 мм. Краситель из каждой полоски элюируют 4 мл 0,01 н. водного раствора NаОН, настаивают 30 мин и затем определяют оптическую плотность растворов на спектрофотометре СФ-4 при λ = 590 нм (максимум поглощения бромфенолового синего). На основании полученных данных вычерчивают кривые в координатных осях: оптическая плотность – расстояние на электрофореграмме. По числу максимумов на кривой судят о числе белковых фракций. Для вычисления содержания отдельных фракций площадь отдельных фракций делят на общую площадь, ограниченную кривой.

Для получения достоверных данных необходимо проанализировать не менее 10 электрофореграмм. Средняя абсолютная ошибка при определении процентного содержания каждой фракции не должна превышать ±4 %.