I этап:

а) бактериоскопию мазков и исследование на под­вижность бактерий из нативного материала проводят только при исследовании материала от больных и тру­пов с подозрением на холеру;

б) испражнения, рвотные массы больных, а также содержимое кишечника, желчного пузыря и суспензию из кусочков слизистой кишечника трупа засевают в 50—100 мл накопительной среды и петлей на щелоч­ной агар;

в) при исследовании материала от больных с подо­зрением на холеру применяют ускоренные методы ис­следования нативного материала, изложенные в п. 4 приложения 4.

г) при обследовании подозреваемых на вибрионо­носительство испражнения засевают в 50 мл среды на­копления при индивидуальных анализах .и в 100 мл — при групповых.

Материал, доставленный в 5 мл 1 % пептонной воды, 'полностью используют для посева в 50 мл среды накоп­ления.

II этап:

а) с первой среды накопления производят высев на пластинку щелочного агара и- в 5—8 мл второй среды накопления. Пересевы в жидкие и на плотные среды производят с поверхности жидкой среды большой бак­териологической петлей диаметром 5 мм;

б) при отрицательных результатах ускоренных методов исследования нативнвго материала их повторяют после 6 ч инкубации яа первой среде накопления.

III этап:

а) производят высев со второй среды накопления на

щелочной агар;

б) посевы нативного материала: просматривают в

проходящем свете невооруженным глазом или с помо­щью лупы, также (особенно в вечернее или ночное вре­мя) под стереоскопическим микроскопом с косым осве­щением (приложение 4) и отбирают колонии для иден­тификации культуры. Колонии холерных вибрионов в типичной S-форме круглые, гладкие, плоские, голубо­ватые, гомогенные с ровными краями, прозрачные в проходящем свете и серо-голубые под стереоскопиче­ским микроскопом. В посевах могут также встречаться атипи.чные колонии: мутные с плотным центром, пиг­ментированные (коричневые или желтые), мельчайшие

коккоподобные, шероховатые.

Отбор колоний можно проводить также по тесту по­ложительной пробы на индофенолоксидазу с использо­ванием реактивов, не требующих применения альфа-нафтола (1% водных растворов тетраметилпарафенил-ендиамина гидрохлорида, или диметилпарафенилендиа-мина дегидрохлорида, или этилоксипарафенилендиами-на сернокислого), по методике, изложенной в п. 5. Куль­туру отсевают не позднее 30 мин после нанесения пре­парата;

— при наличии подозрительных колоний (типичных

и атипичных) ставят на стекле ориентировочную реак­цию агглютинации с холерной 01 и RO сыворотками в разведении 1/50. При положительной реакции и при на­личии нескольких подозрительных колоний ставят еще раз ориентировочную реакцию с сывороткой в разведе­нии 1/100 и сыворотками Огава и Инаба в разведении 1/50 или культуру изучают иммунолюминесцентным ме­тодом.

Положительная ориентировочная реакция агглюти­нация с холерной 01 сывороткой в разведении 1/100 и вариантоспецифической в разведении 1/50 ил'и положи­тельная реакция с люминесцирующими антителами в сочетании с морфологическими и культуральными при­знаками позволяет выдать на данном этапе предвари­тельный положительный ответ;

— с колониями, агглютинирующимися на стекле хо­лерными диагдостическими сыворотками 01, проводят

ускоренную идентификацию по основным признакам по методике, изложенной в п. 3, и при наличии четких поло­жительных результатов выдают окончательный ответ о выделении возбудителя холеры;

— подозрительные на вибрионы колонии, агглюти­нирующиеся и неагглютинирующиеся холерными 01 и RO сыворотками, отсевают на одну из полиуглеводных (лактозо-сахарозная, Клиглера, Ресселя и др.) сред и на сектор пластинки щелочного агара для окончатель­ной идентификации.

IV этап:

а) посевы дативного материала:

— проводят полную идентификацию выделенных на предыдущем этапе культур холерных вибрионов и до­полнительное исследование их свойств (вирулентность, фаговар, чувствительность к антибиотикам и т. п.);

— отбирают культуры на полиуглеводных средах с типичным для вибрионов характером роста: на двууг­леводных средах (лактозо-сахарозная, глюкозо-лактоз-ная и др.) наблюдается изменение цвета столбика, ха­рактерное для кислой реакции без образования газа при сохранении цвета скошенной части; трехуглеводная среда Клиглера полностью желтеет без образования газа;

— те же культуры на щелочном агаре проверяют на наличие индофснолохсидазы;

— определяют морфологию микроорганизмов и чис­тоту отобранных по этим признакам культур, выросших на щелочном агаре и полиуглеводных средах;

— культуры, имеющие характерный рост на'полиуг­леводной среде или дающие положительную пробу на оксидазу, проверяют в ориентировочной реакции агглю­тинации с холерными сыворотками 01 и RO;

— проводят ускоренную идентификацию культур, агглютинирующихся на стекле холерной 01 сывороткой, и в положительных случаях сообщают окончательный ответ о выделении культуры холерного вибриона; иден­тифицируют культуры по сокращенной и полной схе­мам (рисунок);

— с культурами, не агглютинирующимися на стек­ле холерными 01 сыворотками, но оксидазоположитель-ными и имеющими характерный для вибрионов рост на полиуглеводной среде, ставят тесты для окончательной идентификации до рода и вида;

б) посевы с первой среды обогащения:

Схема лабораторного исследования на холеру Условные обозначения: I и II—среда накопления; ЩА—щелочной агар; ПУС—полиуглеводная среда; ОП—оксидазная проба; ОРА— ориентировочная реакция агглютинации; АГ — агглютинация;

* исследуют на кишечную группу

— отбирают подозрительные колонии и изучают по методике, изложенной в п. «б» этапа III. V этап:

а) посевы нативного материала:

— учитывают результаты окончательной идентифи­кации и дополнительного изучения культур холерных вибрионов; при положительных результатах выдают окончательный ответ;

— учитывают результаты идентификации неагглю­тинирующихся на стекле культур, отобранных с посе­вов на полиуглеводную среду и пробой на оксидазу;

б) посевы с первой среды обогащения: проводят изу­чение отобранных культур по методике, изложенной в п. «а» этапа IV-

в) посевы со второй среды обогащения: отбирают по­ложительные колонии и изучают их описанным выше способом (п. «б» этапа III).

VI этап:

а) посевы с первой среды обогащения:

— учитывают окончательные результаты идентифи­кации культур холерных вибрионов; при положительном результате выдают окончательный ответ, если он не был выдан ранее;

— учитывают результаты идентификации культур, неагглютинирующихся на стекле 01 сывороткой, отоб­ранных по характеру роста на полиуглеводной среде и пробой на оксидазу;

б) посевы со второй среды обогащения: изучают отобранные культуры по методике, изложенной в п. «а» этапа IV.

VII этап:

— учитывают результаты идентификации культур, выделенных на средах с высевами со второй среды обо­гащения, выдают при положительном результате окон­чательный ответ, если он не был выдан ранее.

При использовании на этапах исследования плотных элективных питательных сред (ТСВ, среды «К») отбор колоний ведут по признакам, характерным для этих сред (приложение 2).

Обследование объектов окружающей среды

- Схема исследования материала объектов окружаю­щей среды отличается от анализа материала от людей только на первом этапе.

Вода поверхностных водоемов и водопр оводн ая

В зависимости от времени доставки пробы воды воз­можны варианты посевов в целях первичного накопле­ния вибрионов:

а) к 'исследуемой воде добавляют раствор основного пептона до 1 % концентрации, определяют рН, подще­лачивают в случае необходимости 10% раствором гид-роксида натрия до рН 8,0. Анализ пробы (1 л) прово­дят в двух объемах по 500 мл. Время инкубации в та­ком объеме — 8—10 ч. Вторая среда накопления — в объеме 16 мл, время инкубации в среде без теллуриТа калия 6 ч, с теллуритом калия — 18—20 ч;

б) в исследуемую воду в двух объемах по 500 мл до­бавляют основной раствор пептона до 1% концентрации :и теллурит 'калия из рабочего разведения 1:1000 до '^концентрации 1 : 100000 или 1 : 200 000 в соответствии с I данными проверки. Устанавливают - рН 8,0. Время ин-': кубации — 12—24 ч, вторая среда накопления — 10 мл среды без теллурита калия, время инкубации — 6ч;

; в) после установления щелочной реакции и добавле­ния основного раствора пептона до 1% концентрации пробы сохраняют при комнатной температуре (не выше 25° С) до утра (первая среда накопления). В начале следующего дня засевают 5 мл поверхностного слоя в 100 мл 1% пептонной воды (вторая среда накопления) и делают высев на щелочной агар; высев со второй сре­ды накопления через 6 ч инкубации;

г) воду фильтруют через мембранные фильтры № 2 и 3, которые вместе с осадком помещают в нако­пительную среду и на агаровые пластинки; из осадка -на фильтре можно делать мазки для окраски холерной ' люминесцирующей сывороткой, а также исследовать его в РПГА.

Исследование проб воды с помощью реакции пассив­ной гемагглютинации целесообразно при высокой обсе-мененности объекта неагглютинирующимися (НАГ) виб­рионами (приложение 10, п. 1). Воду можно также ис­следовать с использованием в качестве ингибитора по­сторонней флоры моющего вещества «Прогресс» (при­ложение 10, п. 1). При интенсивном бактериологиче­ском загрязнении проб следует использовать третью сре­ду накопления.

Хозяйственно-бытовые сточные воды

Сточные воды (1 л) фильтруют через бумажный или марлевый фильтр для освобождения от механических примесей (при необходимости).

После добавления к пробам основного раствора пеп­тона до 1% концентрации устанавливают рН 8,0 и ин­кубируют в объемах по 500 мл 8—10 ч (первая среда накопления) или с добавлением теллурита калия' 1: 100000 (1 : 200 000) — 12—24 ч.

При заборе сточных вод марлевыми тампонами последние помещают в широкогорлые колбы или банки с накопительной средой (500 мл).

Г и д р о б и о н Т Ы

Лягушку непосредственно перед исследованием обез-движивают уколом иглы в спинной мозг, фиксируют за лапки на препаровальной доске брюшком вверх. По­верхность брюшка 'обрабатывают спиртом, ножницами делают медиальный .разрез от анального отверстия до грудной 'полости. Пинцетом берут желчный пузырь, от­секают от печени, разрезают стерильными ножницами и делают отпечаток на пластинке щелочного агара. Ос­татки желчи вместе с желчным пузырем помещают во флаконы с 50—100 мл 1% пептонной воды (первая сре­да накопления). Стерильными ножницами разрезают желудок, содержимое которого засевают в 1 % пептон-ную воду, а внутренней поверхностью стенки делают от­печатки на агаровые пластинки. Посев кишечника про­изводят таким же образом, отсекая несколько петель ножницами. Отдельно исследуют верхний, средний и нижний отделы кишечника.

Крупных рыб исследуют, засевая в том же порядке в 1 % пептонную воду содержимое желчного пузыря, желудка, кишечника. Мелких рыб (мальков) измельчают ножницами по 10—20 экземпляров в одной пробе и де­лают посев суспензии петлей на чашку со щелочным ага­ром ив 1 % пептонную воду. Дафний и рачков растира­ют в ступке и засевают 'петлей в 1 % пептонную воду. У 'раков исследуют кишечник, делая посев содержимого на среду накопления и слизистой стенки отпечатком на агаровую ореду.

Пищевые продукты

Безалкогольные напитки исследуют тем же методом, что и воду. Молоко в количестве 5 мл сеют в 50—100 мл среды накопления или к 0,5 л молока добавляют ос­новной раствор пептона до 1 % концентрации его в мо­локе. Другие молочные продукты (кефир, сметана, тво­рог, мороженое и т. д.) засевают в количестве 5—10 г в 1 % пептонную воду.

Твердые пищевые продукты измельчают, растирают в ступке с физиологическим раствором и засевают в ко­личестве 10 г в 100 мл накопительной среды и петлей на агаровые среды.

Масло засевают в жидкую среду накопления в ко­личестве 5—10 г, размягчив его в термостате, или дела­ют посев смыва с поверхности его кусочков. После по­сева продукта устанавливают рН 8,0.

Особенности исследования при осуществлении эпидемиологического надзора

При проведении эпидемиологического надзора за хо­лерой исследование материала от здоровых людей и больных острыми кишечными заболеваниями без подо­зрения на холеру при отсутствии возможности двухсмен­ной работы можно проводить в условиях односменной работы, используя I % пептонную воду с теллуритом ка­лия в качестве первой или второй среды накопления. Наиболее целесообразно доставлять в лабораторию ис­пражнения больных в течение не более 2 ч после взя­тия пробы. В этот период допускается также взятие ис­пражнений в 1% пептонную воду. Во всех случаях ма­териал необходимо брать немедленно при поступлении больного и обязательно до начала лечения, решая воп­рос о выборе среды для транспортирования и порядке исследования в зависимости от продолжительности раз­рыва времени с момента взятия пробы до поступления ее в лабораторию. Примерная схема забора материала от больных в 1 % 'пептонную воду и порядок дальней­шего исследования его на холеру с учетом различного времени доставки в лабораторию представлены в

табл. 1.

В течение рабочей недели для отбора проб использу­ют 1 % пептонную воду без теллурита калия в объеме 5—10 мл во флаконах или пробирках (транспортная среда). В пробы во флаконах в лаборатории доливают соответствующую среду накопления в количестве 50 мл, а из пробирок все 5—10 мл транспортной среды с мате­риалом переносят в '50 мл среды накопления.

Пробы до отправления в лабораторию сохраняют при комнатной температуре (не выше 25° С) в баках, ящике, шкафу в специально выделенной 'комнате, за­крывающейся на замок.

Продолжительность сохранения проб в указанных условиях — до 24 ч. Если температура в помещении превышает 25° С, материал следует .брать в 5—10 мл 1% пептонной воды с теллуритом калия.

На выходные дни в порядке исключения допускается Такой вариант: забор материала в 50 мл 1% пептонной воды с теллуритом калия (транспортная среда); допу­стимое время сохранения проб до начала исследования при температуре не выше 25° С—60 ч, 25—30° С — 48 ч;

в лаборатории 3 мл поверхностного слоя среды с мате-

Таблица I

Порядок забора и исследования материала в зависимости от времени доставки его в лабораторию в 1% пептонной воде (примерная схема)

со
(-
я. я я в. я	Время взятия материала	Время доставки в лабораторию	Среда для взятия проб	Назначение среди	Первая среда накопления	Вторая среда накоп­ления, высев с. первой среды	Высев со второй среды
т						накопления	накопления
s.
1	6.00—10.00	До 10.00	1. 1% п.в. 50 мл (не более 3 ч хранения) 2. 1 % п.в. 5—	1. Среда на­копления 2. Транспорт­ная среда	1. Среда с доставленным материалом 2. Посев в	Через 6 ч инку­бации пересев в 1 % п.в. с т.к. и вы­сев	В начале следующего рабочего ДНЯ
			10 мл		50 мл 1 % п.в.
2	10.00 до кон­ца рабочего дня лаборатории	После 10.00 в течение рабоче­го дня	1% п.в. 5— 10 мл	Транспорт­ная среда	5—10 мл сре­ды с материа­лом в 50 мл 1 %	9.00 следующего дня пересев в 1 % п.в., высев	Через 6 ч инкубации
					п.в. с т.к.
3	По оконча­	До 10.00 сле­	1% п.в. 5—	Транспорт­	5—10 мл сре­	Через 6 ч инку­	В начале
	нии рабочего дня лаборато­	дующего дня	10 мл	ная среда	ды с материа­лом в 50 мл	бации пересев в 1 % п.в. с т.к. и вы­	следующего рабочего
	рии				1% п.в.	сев	ДНЯ
4	Выходные-	До 10.00	1% п.в. с т.к.	То же	То же	То же	То же
	дни лаборато­		50 мл
	рии

Примечание. П.в. — пептонная вода; т.к. — теллурит калия; условия хранения проб — комнатная тем­пература не выше 25° С.

риалом переносят в 50 мл 1 % пептонной воды без теллурита калия (первая среда накопления) и делают вы­сев на чашку щелочного агара с дальнейшим исследо­ванием по изложенной схеме.

На флаконах (пробирках) с пептонной водой, пере­даваемых для отбора проб, должна быть этикетка или надпись с указанием названия среды и времени ее при­готовления. В стационарах и медицинских пунктах сре­ды для отбора проб рекомендуется сохранять не более 2 сут при температуре не выше 10° С.

При подозрении на заболевание холерой испражне­ния или рвотные массы берут не только в пептонную воду, но и в стерильные банки, направляя их немед­ленно в лабораторию. Исследование в этих , случаях проводят ускоренным и классическим методами с шес­тичасовой инкубацией без теллурита калия..

3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ КУЛЬТУР ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

Возбудителями холеры являются бактери рода Vibrio вида V.cholerae серогруппы 01. Холерные вибрионы серогруппы 01 имеют два биовара (cholerae и eitor) и три серовара (Inaba, Ogawa, Hykoshima).

К V.cholerae 01 (биоваров cholerae и eitor) относят­ся грамотрицательные аспорогенные полиморфные па­лочки (прямые или изогнутые с одним полярно располо­женным жгутиком), образующие индофенолоксидазу, ферментирующие глюкозу как в аэробных, так и в анаэробных условиях, декарбоксилирующие лизин и ор-нитин, но не расщепляющие аргинин, относящиеся по Хейбергу к I ферментативной группе, агглютинирующие­ся холерными сыворотками 01, Огава (Инаба) до диаг­ностического титра. Типичные культуры хорошо лизи-руются соответствующим диагностическим фагом.

Таксономическое определение вибрионов проводится с учетом современной классификации (табл. 2) и основ­ных таксономических признаков, дифференцирующих представителей различных родов и видов семейства Vibrionaceae (табл. 3,4). Дифференциальные признаки биоваров V.cholerae 01 и ферментативных вариантов по П^уппам Хейберга представлены в табл. 5,6.

Идентификация возбудителей холеры предусматри-иает изучение культур, выделенных на различных эта­пах исследования, в целях определения или исключения их принадлежности к вибрионам вида V. cholerae ce-

Т а б л и ц а 2

Таксономия Vibrio cholerae 01

(По классификации подкомитета по таксономии вибрионов Международного комитета по систематике бактерий)

Таксономическая категория	Таксоны	Таксоны других представителей
Семейство		Vibrionaceae
Роды семейства Vib-	vibrio	Aeromonas, Plesiomo-
rionaceae		nas, Photobacterium, Lu-
		cibacterium
Виды рода Vibrio		V. parahaemolyticus,
		V. albensis, V. alginoliti-
		cus, V. costicola
Серогруппы вида	01	«He 01» (НАГ-вибрио-
V. cholerae		ны)
Биовары серогруппы 01	cholerae eitor
Серовары серогруп­	Jnaba
пы 01	Ogawa
-	Hykoshima	'

рогруппы 01. Представители этого же вида (V. chole­rae), относящиеся к другим серологическим группам («не 01»), не являются возбудителями холеры и до окончательного решения таксономического комитета их обозначают соответственно как V. cholerae 02, 03,... и т. д. или условно как НАГ-вибрионы.

Предварительную идентификацию проводят по ком­плексу признаков, 'включая морфологию колоний, мор­фологию и подвижность микробных клеток, ориентиро­вочную реакцию агглютинации с холерными сыворотка­ми 01 и RO в разведении 1 : 100 и сыворотками вариан­тов Огава и Инаба 1 : 50.

Окончательную идентификацию агглютинирующихся на .стекле культур можно проводить по сокращенной или полной схеме.

Сокращенная идентификация включает изучение культуры в развернутой реакции агглютинации с холер­ными сыворотками вариантов Огава и Инаба, чувстви­тельности к диагностическим фагам «С» и Эль-Тор и оп­ределение принадлежности к I биохимической группе Хейберга. Серовар холерного вибриона определяют по результату реакции агглютинации с вариантоспецифи-ческими сыворотками Огава и Инаба менее 1/2 титра

сыворотки. Культуры, реагирующие с сыворотками обо­их вариантов не менее чем до 1/2 титра, относят к серо-вару Гикошима.

Полная схема идентификации культур вибрионов 01, кроме названных тестов, предусматривает постанов­ку дополнительных тестов, определяющих принадлеж­ность к биовару: гемагглютинация, чувствительность к полимиксину, гемолитическая активность (рис. 1, табл. 5). Для некоторых измененных культур изучаются свойства, определяющие принадлежность к роду Vibrio (табл. 3).

Таблица 3

Характеристика микроорганизмов родов Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas семейства Vibrionaceae

Условные обозначения: + — положительный результат; — — отрицательный результат; +— — возможны оба варианта; (+) или \ I — встречается редко.

Таблица 4 Дифференциальные признаки микроорганизмов рода Uibrio

	V. ch	olerae
			V. alben-	V.para-	V. algino-	V.costi-	V. angui-
Признаки			sis	haemo-	liticus	cola	larum
		02, 03		lytlcus
	01	и т. д.
Индофенолоксидаза	+	+	+	+	+	+	: +
Лизин-декарбоксилаза	+	+	+	+	+
Орнитин-декарбоксилаза	+	+	+	+	+	—	—
Аргинин-дегидролаза	- —	•—	—	—	—	+	+
Ферментация:
маннита	+	+	+.	+	+	+—	+
сахарозы	+	+	+\	—	+	+	+
маннозы	+	+—	+—	+	+	+ •	+—
арабинозы	—	—	—	• +—	| ^,		1
Индолообразование	+	+	+—	+	+	—	- +
Желатиназа	+	+	+	+	+	+—	+
Лецитиназа	+	+	!.	+	+	+—	+—
Агглютинация холерной сывороткой 01	+	—	——	—
Чувствительность к фагам «С» и Эль-Тор	+	-(+)	——	—	—	—	—
Рост при температуре:
5° С	. — .	—	.——	—		+	+
37° С	+	+	+	+	+	+—	1^
43° С	+	+	~	+	+		———