77. Пестициды из класса фенолов (днок, диносеб, зоокумарин). Качественное обнаружение и количественное определение. Токсикологическое значение и метаболизм.
Пестициды из класса фенолов
Фенолы проявляют широкий диапазон физиологического действия и являются фунгицидами, бактерицидами, инсектицидами и гербицидами. Причем пестицидная активность фенолов возрастает при введении в ароматический радикал различных заместителей, особенно нитрогруппы. Из многочисленных производных динитропроизводных фенолов практическое значение приобрели ДИНОК и ДИНОСЕБ, ЗООКУМАРИН.
По физическим свойствам препараты (ДИНОК, ДИНОСЕБ) представляют собой желтые кристаллические вещества. Изолирование при ХТА из внутренних органов трупа, крови, мочи возможно как подщелоченной, так и подкисленной водой, очистка -хроматографией в тонком слое силикагеля. Качественное обнаружение проводят по реакции с раствором натрия гидроксида - появляется желтое окрашивание, либо с использованием других реакций, характерных для фенолов. Количественное определение проводят СФМ методом, максимум поглощения наблюдается при К = 370 нм.
ДИНОК
ДИНОСЕБ
Зоокумарин
3-(α-ацетонилбензил)-оксикумарин
Зоокумарин – бесцветный кристаллический порошок, Тем пл=159-161, нерастворим в воде, хорошо растворим в хлороформе, ацетоне, растворах едких щелочей.
Применение: зооцид, отрава для крыс.
Применяется в виде порошка с содержанием действующих веществ до 1%. Нарушает протромбинообразовательную функцию печени крыс и человека. Вследствие чего повышается проницаемость капилляров.
Изолирование данных веществ производят путём прямой экстракции органическими растворителями внутренних органов трупа, мочи, лучше подщелоченной натрия бикарбонатом.
Качественное обнаружение
реакция с раствором едкой щелочи – желтое окрашивание;
реакция образование индофенола, и другие реакции, характерные для фенолов (с хлоридом железа (III).
Количественное определение
Спектрофотометрическое определение по закону Бугера-Ламберта-Бера.
Этапы химико-токсикологического анализа зоокумарина
1 этап – изолирование
Объект (кровь) + 3н раствор 2 мл кислоты соляной + дихлорэтан (экстракция) из плазмы крови. Экстракт упаривают. К сухому остатку добавляют ацетон.
2 этап – обнаружение
Проводят дополнительную очистку сухого остакта методом ТСХ. В качестве элюента используют бензол. Далее – проводят повторную ТСХ в растворе элюента – смеси ацетона и дихлорэтана в соотношении 9:1. Проводят детекцию в УФ-спектре.
3 этап – количественное определение
Метод спектрофотометрии при длине световой волны = 305 нм.
78. Пестициды класса фосфорорганических соединений (хлорофос, карбофос) в химико-токсикологическом отношении.
Фосфорорганические пестициды (ФОП). Одна из наиболее распространенных и многочисленных групп пестицидов. К ним относятся афуган, актеллик, дибром, карбофос, бромофос, фталофос, хлорофос, цидиал и др.
Большинство ФОП обладают высокой летучестью, слаборастворимы в воде, хорошо - в органических растворителях. По стойкости в окружающей среде значительно уступают ХОП. Однако некоторые из них сохраняют свои токсические свойства в почве и на растениях в течение нескольких месяцев и более, в результате чего возможно их поступление в организм человека с продуктами питания, воздухом и водой. Способны проникать через неповрежденную кожу, различные биологические мембраны и гематоэнцефалический барьер. Установлено, что в течение 11 недель 30% немакура, внесенного в почву, поглощается растениями. Более устойчивы остаточные количества ФОП в плодах цитрусовых. Это объясняется их растворением в маслах кожуры плодов.
Хотя ФОП не накапливаются в организме ток интенсивно, как ХОП, они все же обладают кумулятивными свойствами в результате суммирования токсических эффектов - функциональной кумуляцией.
В клинической практике наиболее часто встречаются острые отравления карбофосом, хлорофосом, метафосом. Летальная доза для человека при приеме per os составляет для метафоса 0,2-2 г, для карбофоса, хлорофоса - 5-10 г.
Токсическое действие ФОП связано с угнетением активности холинэстеразы (ХЭ). При взаимодействии ХЭ с ФОП образуется устойчивый к гидролизу, либо не способный к нему (в случае воздействия, например, Зорина) фосфорилированный фермент, не способный регулировать процессы разложения ацетилхолина в синапсах. В результате накопления ацетилхолина наблюдаются характерные изменения в ЦНС и вегетативной нервной системе, проявляющиеся головной болью, ухудшением памяти, нарушением сна, дезориентацией в пространстве, бронхоспазмами судорогами, угнетением дыхания. Для некоторых характерны невриты, парезы, параличи.
В организме метаболизм ФОП протекает по пути окисления (с потерей радикалов), десульфирования и дехлорирования. При этом могут образовываться более токсичные соединения.
К осложнениям, развивающимся при тяжелых отравлениях ФОП, относятся пневмонии, поздние интоксикационные психозы и полиневрозы, возникающие через несколько дней с момента отравления.
Достоверно установлены генетические нарушения (повышение эмбриональной смертности и врожденных аномалий у потомства) у лиц, перенесших острые отравления ФОП, и у рабочих промышленных предприятий, подвергающихся хроническому воздействию низких концентраций этих веществ.
Химико-токсикологический анализ ФОП имеет чрезвычайно важное значение для доказательства ФОП, т. к. они, в большинстве случаев, не вызывают каких-либо специфических морфологических изменений в организме человека.
ХТА представляет большую сложность ввиду большого ассортимента ФОП, быстрого метаболизма в организме и образования новых продуктов, а также при изолировании и обнаружении.
Изолирование
Объектами исследования при ХТА могут быть как сами ядохимикаты, так и биологические объекты - желудок с содержимым, печень, почки в смертельных случаях отравления и биологические жидкости - кровь, моча - у живых лиц при установлении диагноза острого отравления, а при санитарно-гигиенических исследованиях - пищевые продукты, почва вода.
Изолирование из внутренних органов трупа основано на настаивании измельченных органов с 3-х кратным объемом смеси ацетон-этанол-вода (1,5:1,5:1) при рН 5-5,5 в течение 4 часов с последующим экстрагированием хлороформом.
Изолирование из биологических жидкостей проводят при рН 5 прямой экстракцией хлороформом с последующей концентрацией извлечения.
Обнаружение и определение
Тонкослойная хроматография в анализе ФОП - второй по значимости метод. По сравнению с методом ГЖХ он менее чувствителен и специфичен, не дает точной количественной оценки, но преимущество его в том, что он не требует специальной аппаратуры и, при необходимости, может быть использован в любой лаборатории.
Метод ТСХ используется для очистки и разделения ФОП, идентификации и ориентировочного количественного определения.
Для хроматографирования используют пластины «Silufol», либо стеклянные пластины с силикагелем, фиксированным гипсом. Хроматограммы развивают в одной из систем растворителей 1 гексан-ацетон 4:1,2 бензол
Общая проба на ФОП
На пластину наносят 2 точки метчика с содержанием смеси ООП 10 и 20 мкг (для ориентировочного количественного определения) и аликвоту извлечения Хроматографируют в одной из систем затем проявляют, последовательно обрабатывая пластину;
1 Парами брома - наблюдают буро-коричневые пятна (не специфична, дают соэкстрактивные вещества),
2 Спиртовым раствором железа (III) хлорида и кислоты сульфосалициловой наблюдают пятна желтого или белого цвета (фосфат-ион);
При положительном результате общей пробы на ФОП устанавливают класс ФОП
Определение класса ФОП
На три хроматографические пластины наносят аликвоты экстрактов как в общей пробе. После хроматографирования пластины обрабатывают следующим образом: 1-ю пластину (на серусодержащие ФОП) с палладия хлоридом, наблюдают пятно желтого цвета, либо с серебра нитратом и бромфеноловым синим, при этом наблюдают пятно лилового цвета (после обесцвечивания фона кислотой лимонной).
2-ю пластину (на ФОП с нитрофенильным радикалом) опрыскивают спиртовым раствором едкого натрия. При наличии в пятне свободных нитрофенолов (метаболиты) - желтая окраска появляется сразу в присутствии ФОП с нитрофенильным радикалом - желтая окраска появляется после нагревания.
3-ю пластину (на хлорофос и дихлофос) обрабатывают щелочным раствором резорцина, наблюдают пятна, окрашенные в розовый цвет.
Пятна, выявленные во всех случаях, сравнивают с пятнами метчика. При совпадении Rf искомого ФОП с Rf метчика выполняют подтверждающие реакции и проводят ориентировочное количественное определение по площади пятна. Содержание ФОП рассчитывают по формуле:
X = A * S2 / B * S1
X – содержание ФОП в объекте (мкг/кг);
A – содержание ФОП в стандарте (мкг);
В – навеска пробы в г с учётом аликвоты;
S2 – площадь пятна метчика (мм2);
S1 – площадь пятна пробы (мм2)
При положительном результате общей пробы на ФОП определяют степень угнетения холинэстеразы крови.
Холинэстеразная проба (энзимное экспозиционно-колориметрическое определение) - основана на способности ФОП угнетать активность фермента холинэстеразы. При угнетении холинэстеразы нарушается регулирование разложения ацетинхолина, что приводит к его накоплению и непрерывному раздражению нервных клеток.
Как следствие, нарушаются функции ЦНС и вегетативной НС. Это приводит к тяжелейшим расстройствам - судорогам, параличам, бронхоспазму, угнетению дыхания и сердечной деятельности
+ холинэстераза +
(СНЗ)3-NСН2СН2OСОСНЗ ———————> (CH3)3-NCH2CH2OH + НОСОСНЗ ацетилхолин холин уксусная кислота
В норме ацетилхолин под влиянием фермента холинэстеразы разрушается с образованием холина и уксусной кислоты, в результате чего изменяется рН смеси ацетилхолин + холинэстераза.
Изменение рН можно зафиксировать с помощью кислотно-основных индикаторов например, бромтимолового синего. Изменение окраски в контроле (от синей к желтой) происходит в течение 10-15 минут. В присутствии ФОП (как антихолинэстеразных веществ) окраска индикатора не изменяется более продолжительное время, чем в контроле.
Угнетение активности холинэстеразы рассчитывают в % по формуле:
X = 100- 100*T / T1
T – время изменения окраски в контрольной пробе;
Т1 – время изменения окраски в исследуемой пробе;
Угнетение активности холинэстеразы более чем на 10 %, указывает на возможное присутствие в пробе ФОП.
Экстрактивные вещества органов трупа, крови, мочи без глубокого гнилостного разложения не мешают определению. Продукты гниения могут снижать активность холинэстеразы на 10-50 %. В этом случае проводят предварительную очистку пробы на колонке с активированным углем.
Холинэстеразная проба неспецифична, используется как предварительный ориентировочный тест не имеющий отрицательного судебно-химического значения.
Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) в анализе ФОП
ГЖХ - наиболее современный метод, практически вытеснивший традиционные аналитические методы вследствие высокой чувствительности, селективности, экспрессности и возможности сочетания качественного и количественного анализа в одной пробе без предварительного изолирования и очистки.
Остаток, полученный после отгонки растворителя, подвергают исследованию на газовом хроматографе с термоионным детектором, который наиболее чувствителен к соединениям, содержащим фосфор. Принцип действия термоионного детектора заключается в том, что соли щелочных металлов испаряясь в пламени горелки, селективно реагируют с соединениями, содержащими галогены и фосфор, в результате чего в ионизационной камере появляется ионный ток.
Подвижная фаза - азот, в качестве неподвижной фазы используют различные ВМС (под марками SE-30, ОУ-17, ХЕ-60), обладающие различной полярностью, что позволяет повысить селективность метода и эффективно разделить большое число ФОП. Граница определения составляет от 0,001 до 0,0001 г/л, что делает возможным обнаружение следовых количеств ФОП.
Следует отметить, что анализ на содержание ФОП необходимо проводить возможно быстрее (не позднее 2-х часов после взятия крови). При оценке результатов важно учитывать снижение концентрации ФОП в крови при ее хранении.