Хроматографические методы анализа.

Хроматография разработана русским ученым М.С. Цветом в 1903 г. В настоящее время она бурно развивается и широко используется в фармацевтической химии. Хроматографическое разделение основано на том, что вещество, растворенное в жидкости, перемещается вместе с нею и то же время удерживается на поверхности твердой фазы за счет адсорбции, ионного обмена или другого механизма. Хроматографию можно определить как процесс, основанный на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента. В зависимости от природы подвижной и неподвижной фазы выделяют различные методы хроматографии.

Тонкослойная хроматография (тсх).

Этот метод широко применяется в аналитической токсикологии при исследовании веществ, вызывающих острое отравление. Он позволяет провести качественное и полуколичественное определение яда. В основе ТСХ лежит разделение смеси лекарственных веществ, происходящее на слое адсорбента, нанесенном на подложку. Является простым, достаточно чувствительным и доступным для практической работы, не требующим дорогостоящих приборов. Он дает возможность проводить качественный и количественный анализ фармакологических средств минерального, животного, растительного и микробного происхождения.

Основные этапы анализа включают экстракцию ядовитых веществ из исследуемого материала, очистку экстрактов от посторонних примесей, концентрирование их, хроматографическое разделение на тонком слое пластинки, проявление полученных пятен и количественное определение исследуемого вещества.

Экстракция — это процесс переноса растворенного вещества из одной жидкой фазы в другую, не смешивающуюся с ней. В качестве экстрагирующего растворителя берут обычно органические вещества, в которых хорошо растворяется исследуемое вещество.

Метод распределения между двумя несмешивающимися жидкостями основан на различии коэффициентов распределения ядовитых веществ и сопутствующих веществ между двумя несмешивающимися растворителями. С этой целью обычно используют н-гексан и диметилформамид или ацетонитрил.Осаждение жиров основано на плохой их растворимости в холодном ацетоне, для чего экстракт вымораживают в холодильнике или в приготовленных охлаждающих смесях со льда (снега) и различных солей (хлорида натрия, сульфата и карбоната натрия, нитрата аммония и натрия).Осаждение белков осуществляется коагулирующей смесью, состоящей из 5 г аммония, 10 мл 85 % раствора ортофосфорной кислоты и до 1 л дистиллированной воды.

Концентрирование экстрактов осуществляют при помощи вакуумного ротационного испарителя, испарения с капилляром под вакуумом на водяной бане или в токе воздуха на водяной бане. Самые низкие потери препаратов бывают при использовании ротационного испарителя. Во всех случаях необходимо не повышать температуру водяной бани свыше 4°Cи не упаривать досуха очищенные экстракты.

Разделение лекарственных веществ, содержащихся в концентрированном экстракте после нанесения исследуемого материала производится на пластинках с тонким слоем сорбента в хроматографических камерах, на дне которых находится подвижный растворитель. С этой целью можно использовать готовые пластинки отечественного и зарубежного производства (диафол, силуфол и др.) или приготовленные в лабораторных условиях.

Перед анализом на стартовую линию пластинки (1,5 см от края) наносят в виде точек анализируемые пробы и известные количества стандартных растворов предполагаемых ядовитых веществ при помощи микропипетки или специального микрометрического шприца. Иногда во время нанесения пробы пятно обрабатывают струей теплого воздуха. Размер пятна на слое сорбента в диаметре не должен превышать нескольких миллиметров.

За 1 ч до анализа в хроматографическую камеру заливают подвижный растворитель, уровень которого не должен превышать 0,5 см. Пластинки помещают в растворитель и камеру плотно закрывают. После поднятия фронта растворителя по сорбенту на расстояние 1 см от верхнего края пластинки ее вынимают, отмечают верхнюю границу подъема растворителя (линию фронта), высушивают на воздухе и обрабатывают проявляющим реагентом.

Качественная идентификация ядовитых веществ проводится по величине Rf(отношение расстояния от линии старта до центра пятна к расстоянию от линии старта до линии фронта), которая для каждого яда постоянна. Результаты ТСХ регистрируют в виде коэффициентов удерживания (Rf).Rfрассчитывается следующим образом:

_{Расстояние, пройденное от старта анализируемым образцом}

Rf= ---------------------------------------------------.

^{Расстояние, пройденное от старта фронтом растворителя}

Более удобным является показатель Rfx100 (hRf), особенно в случаях, когда используется стандартная пластина 10 см. На воспроизводимостьRfможет оказать влияние ряд факторов, но это влияние может быть сведено к минимуму, если вместе с каждым образцом анализируются стандартные соединения.

Развитие аналитической ТСХ идет по пути повышения чувствительности, унификации процесса и условий хроматографии. Использование готовых систем, пластин, камер, проявителей и идентификационных атласов гарантирует высокую воспроизводимость, надежность анализа и исключает субъективный фактор. Количественный анализ заключается в измерении площадей пятен исследуемого вещества и известного количества стандартного вещества. Более точный результат дает определение интенсивности окраски и диаметра пятен при помощи специальных приборов- денситометров. Прибор регистрирует их в виде пиков, по площади и высоте которых рассчитывают количество исследуемого вещества.