Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

14. Рекомбинация 135

Рис. 14.2. А. Разделение фаговых частиц (фага λ), состоящих целиком из легких (LL) и целиком из тяжелых (НН) цепей в градиенте плотности раствора CsC1. Содержимое центрифужной пробирки распределяется по фракциям, в каждой из которых с помощью обычного чашечного теста подсчитывают количество фаговых частиц. Б -Г. Распределение по плотности дочерних фагов, образующих на легкой среде в клетках, инфици-

рованных: Б -целиком тяжелыми фагами с низкой множественностью инфекции, B -целиком тяжелыми фагами с высокой множественностью инфекции, Г -целиком тяжелыми фагами двух различных генотипов с высокой множественностью по каждому из них. Профиль распределения фагов с родительским генотипом показан черной, а рекомбинантов дикого типа - цветной линией.

клетку дают потомство с двумя сегрегированными аллелями. В опыте, аналогичном тому, который представлен на рис. 14.2, Г, тяжелые родительские фаги были представлены генотипами λс ⁺ и λс, а среди потомства обнаруживались гетерозиготные фаги с⁺/с. Такие фаговые частицы образуют крапчатые негативные колонии (бляшки), состоящие из прозрачных и мутных участков, которые легко отличить как от прозрачных бляшек, характерных для λс, так и от мутных, образуемых λс ⁺ (рис. 14.3, А). Распределение по плотности фаговых частиц, образующих крапчатые, прозрачные и мутные бляшки, представлено на рис. 14.3, Б. Гетерозиготные фаговые геномы с/с⁺ должны иметь структуру, схематически показанную на рис. 14.3, В. Молекулы ДНК этих фагов содержат пары некомплементарных оснований, которые были незамечены системой репарации клетки и поэтому сохранились в составе ДНК зрелых фаговых частиц.

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

136 Экспрессия генетического материала

Генетический анализ рекомбинации

С помощью генетического анализа удалось идентифицировать ферменты, участвующие в процессе общей рекомбинации у Е. coli. При скрининге мутагенезированных клеток F ^- методом «отпечатков» можно на исходной чашке обнаружить колонии мутантных клеток, неспособных к образованию рекомбинантов при конъюгации с клетками Нина чашке-реплике. Оказалось, что мутации, влияющие на способность к рекомбинации, локализуются в трех генах, обозначенных recА, recВ и recС. При изучении таких мутантов удалось идентифицировать функционирующие в нормальных клетках белки, кодируемые каждым из трех генов.

Белок RecA представляет собой удивительный полифункциональный фермент, вовлеченный как в общую рекомбинацию, так и в репарацию ДНК. Ген recA ⁺ необходим для протекания всех процессов в системе

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

14. Рекомбинация 137

Рис. 14.4. Белок RecA принимает участие в двух последовательных этапах переноса цепей при образовании структуры Холлидея. Этап 1 : перенос одной из цепей двухцепочечной ДНК к комплементарному участку другой молекулы ДНК, содержащему разрыв в гомологичной цепи. Этап 2: реципрокный перенос цепи с образованием области перекреста, которая может перемещаться вдоль двухцепочечных участков ДНК обоих партнеров.

общей рекомбинации у Е. coli. Очищенный белок способен направлять все основные этапы образования структур Холлидея in vitro. Молекулы белка RecA связываются как с двухцепочечными, так и с одноцепочечными молекулами ДНК и, используя энергию гидролиза АТР, могут расплетать двойную спираль ДНК. Благодаря этому оказывается возможным взаимодействие комплементарных цепей различных молекул ДНК, участвующих в рекомбинации. Эта функция белка RecA обеспечивает осуществление процесса конъюгации (синапсиса) молекул ДНК с гомологичными нуклеотидными последовательностями (см. рис. 14.4, этап 1). Белок RecA катализирует также последующую переориентацию цепей с образованием крестообразной структуры Холлидея и дальнейшим перемещением области перекреста (рис. 14.4, этап 2).

Удобной моделью для изучения рекомбинации in vivo могут служить присутствующие в клетках Е. coli небольшие кольцевые молекулы плазмидных ДНК. При электронном микроскопировании очищенных препаратов ДНК плазмиды ColEl видно, что они содержат преимущественно кольцевые молекулы единичной длины, то есть мономеры. Однако удается обнаружить и некоторое количество молекул ДНК, имеющих форму восьмерки, в которой две мономерные плазмиды соединены в одной точке пересечения. Плазмида ColEl содержит один сайт узнавания для рестриктазы EcoRl. Расщепление «восьмерок» этой рестриктазой приводит к образованию двух изомерных форм, напоминающих структуры Холлидея (рис. 14.5). При этом, как видно из рис. 14.5, образуются по две пары плеч одинаковой длины, что указывает на то, что вышеупомянутые «восьмерки» действительно состоят из двух одинаковых плазмидных молекул, соединенных между собой крестообразной перемычкой. В плазмидных препаратах, полученных из штаммов E. coli recА ^-, «восьмерки» не образуются. Это означает, что они, по всей видимости, представляют собой промежуточные структуры, возникающие в ходе гесА ⁺ -зависимой рекомбинации между плазмидами. В то же время эти промежуточные структуры присутствуют в препаратах ДНК из