Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

14. Рекомбинация 757

Рис. 14.15. Локализация сайтов связывания интегразы фага λ с участком POP' с помощью метода «футпринтинга». Аликвоты, содержащие рестрикционный фрагмент, 5'-конец одной из цепей которого помечен ^32Р, подвергали частичному расщеплению неокарциностатином (расщепляет по А и Т) в присутствии и в отсутствие интегразы или гепарина. Набор образующихся фрагментов анализировали с помощью гель-электрофореза (три левые дорожки). В двух правых дорожках — фрагменты, образующиеся при расщеплении того же меченого фрагмента по пуриновым или по пиримидиновым нуклеотидам методом Максама — Гилберта, для идентификации участков последовательности, защищаемых интегразой. (По Hsu P. L, Ross W., Landy Α., 1980. Nature, 285, 85-91.) Reprinted by permission. Copyright © 1980Macmillan Journals Limited.

В том случае, когда нуклеотидная последовательность уже известна, можно установить, какие участки последовательности связываются с определенным белком. Для этого достаточно определить участки, защищаемые этим белком от расщепления. Защищенные участки идентифицируются на основании данных электрофореза, по исчезновению полос, соответствующих продуктам статистического расщепления, концевые нуклеотиды которых попадают в область связывания с белком. Именно этот подход был использован для локализации сайтов связы-

вания интегразы с участком POP' ДНК фага λ. Рестрикционный фрагмент, содержащий участок POP' и меченый ^32Р по одному из 5'-концов, случайно расщепляли ДНКазой I (или любым другим способом, приводящим к образованию одноцепочечных разрывов) в присутствии и в отсутствие интегразы. После этого оба образца нагревали для расхождения цепей, только одна из которых содержала метку, и анализировали с помощью электрофореза. Результаты такого эксперимента представлены на рис. 14.15. При электрофорезе

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

158 Экспрессия генетического материала

образца, расщепленного в отсутствие интегразы, наблюдается полный набор фрагментов расщепления. В случае образца, полученного в присутствии интегразы, выявляются характерные пропуски (или «следы» - footprints), соответствующие участкам последовательности, защищенным от расщепления, благодаря связыванию с интегразой. Сравнивая положения пропусков с расположением фрагментов, образующихся при использовании специфических методов расщепления (также показано на рис. 14.1 5), удается точно идентифицировать защищенные нуклеотиды в известной последовательности области POP'. Как показано на рисун-

ке, интеграза защищает общую кор-последовательность (рис. 14.14), а также один участок в плече Р' и два участка в плече Р. В эксперименте, отраженном на рис. 14.15, для изучения относительной прочности связывания интегразы с различными участками POP' используется конкурентное связывание с ДНК полианиона гепарина. Можно видеть, что гепарин вытесняет интегразу из всех участков связывания, за исключением сайта, расположенного в плече Р'. Вероятно, с этим сайтом интеграза связывается значительно прочнее, чем с другими сайтами узнавания белка в области POP'.