- •1.Антгены и иммуногены. Антигенные детерминанты, эпитопы. Гаптены.
- •3.Антиидиотипические и видоспецифические антитела
- •5. Мка получают с помощью гибридомной технологии, а пка выделяют из сыворотки.
- •6. Методы получения антител
- •7. Стадии получения мка и пка
- •9 Требования к свойствам моноклональных антител:
- •10 Вопрос. Гибридомная технология.
- •12.Рекомбинантные иммунотоксины и иммуноферменты. Иммуноадгезины. Абзимы.
- •13 .Селекция методом фагового дисплея.
- •In vitro и in vivo скрининг библиотек фагового дисплея
- •Вопрос15. Антитела и нанотехнологии.
- •Типы наночастиц
- •17)Трансгенные растения и животные – продуценты антител.
- •18. Классификация методов на основе антител
- •19. Прямые и непрямые иммунохимические методы
- •21. Амплификация сигнала и неспецифическое связывание.
- •23. Способы мечения антител и визуализации комплексов антиген-антитело
- •26)Радиоиммунологические методы.
- •27. Виды ифа. Чувствительность анализа, способы её повышения.
- •29. Ифа. Принцип. Конкурентный и «Сэндвич»-ифа.
- •31. Твердофазные виды ифа. Подбор условий методом «шахматной доски»
- •32. Western-блотинг.Dot-blot. Системы детекции и амплифкации сигнала.
- •33.Метод иммунного блоттинга
- •34.Клеточный ифа. EliSpot. Поляризационный флуороиммуноанализ (пфиа).
- •36.Цитофлюориметрия. Популяционный анализ клеток. Клеточный сортинг.
- •37. Клеточное типирование и селекция клеток. Иммуноцитохимия.
- •38.IgA, IgG, IgM: методы определения, реакция агглютинации
- •40. Флуориметрия и методы на ее основе. Флюоресцентная и конфокальная микроскопия. Локализация антигенов.
- •42. Методы, применяемые в иммунодиагностике
- •43. Фагоциты: исследование функций
- •5. Комплемент, лабораторное исследование функций
- •Иммунные комплексы циркулирующие: методы определения
- •45. Методы выявления клеточных антигенов. Маркеры клеточной активации. Дифференцировочные маркеры лейкоцитов.
- •46.Иммунопрофилактика, иммунотерапия, иммунокорекция, иммуномодуляция. Выбор средств, определение вида и способа иммунокорекции.
- •1. Основные виды иммунокорригирующей терапии
- •2. Выбор средств, определение вида и способа иммунокоррекции
- •48. Оценка фагоцитоза, в- и т-систем иммунитета, активности антителобразующих клеток.
- •49)Иммунопроилактика. Вакцины. Виды вакцин. Способы их получения. Успехи применения вакцинации.
- •50)Иммунодифициты: диагностика и иммунотерапия. Оценка иммунного статуса прииммуннодифицитах.
- •51. Стимуляция пролиферации дендритных клеток. Содействие захвату антигена и его процессингу. Стимуляция ответа эффекторных клеток при помощи прямой презентации антигена.
- •52)Направления имуннотерапии рака. Противораковые вакцины.
- •53.Применение имитаторов опухолевых антигенов. Экстрокорпоральная активация противораковых иммунокомпетентных клеток
- •54.Элиминация раковой опухоли с помощью антител. Ангиостатический подход. Использование цитокинов
- •55. Пробиотики, пищевые волокна.
- •56. Применение иммуномодуляторов при иммунодефицитах.
- •59. Критерии выбора методов для исследования, их применение в биологии, экспериментальной и практической медицине и др. Областях
- •60. Иммунологические подходы и методы, применяемые в медицине
21. Амплификация сигнала и неспецифическое связывание.
Метки сегодня:
радиоизотопы;
ферменты;
флюорохромы;
металлы и металлопротеины.
промежуточные связующие вещества
биотин
дигоксин
Ферменты, используемые в иммуногистохимических методиках, и соответствующие им субстраты
Пероксидаза хренаH2O2
Щелочная фосфатаза
Глюкозоксидаза
Флюоресцентные метки имеют свои недостатки:
- необходимость специального флюоресцентного микроскопа с набором барьерных фильтров;
- низкая чувствительность метода;
- сложность подготовки препаратов;
- быстрое затухание флюоресценции, даже при использовании реагентов, снижающих данный эффект (например, DAPI);
- полученные препараты нельзя хранить.
АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 1 Прямой (А) и непрямой (Б) метод визуализации результатов реакции «антиген-антитело»
Преимущества Б:
вторичные антитела против Fc-фрагмента другого вида животного получать намного проще, также легче присоединить к ним метку;
первичные антитела не несут на себе лишнего груза, а значит, легче и быстрее проникают в ткани, метка не влияет на конформационные изменения после взаимодействия антител с антигеном.
АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 2 - системы с использованием антител против пероксидазы и щелочной фосфатазы (PAP и APAAP-комплексы).
1 этап: первичные антитела
2 этап: вторичные антитела против первичных (связующее антитело)
3 этап: вносятся антитела против пероксидазы или щелочной фосфатазы, полученные от животного того же вида, от которого получены первичные антитела, антигенсвязывающие участки которого заняты соответствующим ферментом.
Формируется комплекс, где с одним антигеном связываются уже 2 молекулы фермента
АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 3 - метод непрямого иммуноокрашивания с использованием биотин-авидинового комплекса (1979)
Биотин
- является коферментом во многих реакциях присоединения (карбоксилирования).
- соединение, стойкое к действию высоких температур, к кислой и щелочной среде, хорошо растворяется в воде и спирте.
- легко может вступать в стойкое соединение с различными белками, в том числе с ферментами и иммуноглобулинами.
- содержится в большом количестве в белках птичьих яиц, где он связан с авидином
Авидин
образует с биотином чрезвычайно стойкий комплекс: К(А)=10(15) моль(-1)
гликопротеид с молекулярной массой 68 кДа
имеет 4 места связывания, к которым можно присоединить биотин или белки
АВС метод Недостатки авидин соединяется с эндогенным биотином, который в большом количестве содержится в печени и почках,
авидин может соединяться с лектинами и заряженными группами в тканях, так как авидин имеет заряд (рI 10,0).
стрептавидин – белок с молекулярной массой около 60 кДа, который получают из микроорганизмов Streptomyces avidinii (SaBC-метод)
не имеет заряда в нейтральной среде, не связывается с эндогенным ферментами и намного меньше с эндогенным биотином. Замена авидина на стрептавидин позволила резко уменьшить фоновое окрашивание и повысить чувствительность метода приблизительно в 8 раз
АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 4 применение полимерных систем
Основой систем является декстрановая молекула, на которой конъюгируют до 20 молекул первичных или вторичных антител и 100 молекул фермента
АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 5 системы, основанные на применении тирамида
Тирамид, предварительно связанный с биотином, под действием пероксидазы переходит в нерастворимую форму и оседает в ткани около фермента. Затем добавляют комплекс стрептавидин-пероксидаза, который присоединяется к тирамиду и усиливает ферментативную активность в месте связывания во много раз.
Первые три этапа такие же, как в ABC-методе. Последующие этапы:
А – в систему добавляют тирамид, связанный с биотином;
Б – под действием пероксидазы тирамид переходит в нерастворимую форму и оседает вокруг комплекса «антиген-антитело».
В – в систему добавляют комплекс стрептавидин-биотин-фермент, который связывается с биотином, связанным с тирамидом.
Неспецифическое связывание.
Способность антител дифференцировать антигены хорошо иллюстрируются различной реактивностью антител по отношению к близким по химической структуре гептенам. Антисыворотка, полученная к одному антигену, может перекрёстно реагировать с родственным антигеном, несущим одну или несколько идентичных или похожих детерминант. Речь идёт о поликлональных антителах. (если кто-то знает, что это не то, поправьте)
22 Система контролей: 1)позитивный,(как должно быть);
2)негативный (когда неспецифическое связывание,когда берем другое а/т вместо первого)
3) изотип контроль для иммуногистологии (каждый изотип имеет Fc – фрагмент). Например,береміммуноглобулін Gокрашиваем,идоказываем,что вторичное антитело не распознают любую часть молекулы.
Контроли нужны всегда. Нужно контролировать бэкграунд. Если сэндвич м.б.ошибки: плохой а/г, первичное а/т. Иммунофлюорография: негат, изотип-контроль – произаодят а/т, которые не к чему не направлены: 1 препарат – специфические а/т, 2 препарат – изотип контроль(если окрашивание, то бэкграунд).