Вопрос15. Антитела и нанотехнологии.

Нанотехнологии - фундаментальные технологии, основанные на манипуляциях с наноструктурами (наночастицами). Наноструктуры – это объекты, размеры которых лежат в диапазоне от 0,1 до 1000 нанометров. В принципе, нанотехнология позволит создавать абсолютно любые объекты, манипулируя отдельными атомами вещества.

Наночастицы – искусственно созданные структуры с диаметром менее 100 нм, полученные с помощью химических и физических методов, обладающие специфическими свойствами, не характерными для исходного вещества, из которого они были получены.

Типы наночастиц

1. Липосомы состоят из мембраны в виде бислоя липидов и молекулы воды внутри, имеют сродство к биологической мембране и используются для повешения эффективности и безопасности использования лекарств.

2. Эмульсии содержат масла в водной фазе, стабилизированные сурфактантом, который поддерживает размер и форму.

3. Полимеры

• полисахаридные хитозановые наночастицы, используются для доставки лекарств. Водорастворимые полимерные гибриды (полимерпротеин – снижает иммуногенность, увеличивает продолжительность полужизни в плазме, повышает стабильность протеинов; и полимерлекарство канъюгаты – целевая доставка к опухоли за счет повышения проницаемости)

4. Керамические наночастицы

5. неорганические поросодержащие биосовместимые могут в подвергаются биодеградации, поэтому могут накапливаться вызывать нежелательные эффекты. Используются в раковой терапии.

6. Металлические наночастицы

• Используются как пассивные или активные транспартеры лекарств.

7. Наночастицы – золотые скорлупки (gold shell)

• сферические наночастицы с диэлектрическим ядром, покрытым тонкой металлической скорлупкой, обычно золотой. Используются для визуализации при биомедицинских исследованиях и терапевтических процедурах

8. Карбоновые наноматериалы: фуллерены и нанотрубки

• . Используются для доставки терапевтических молекул.

9. Quantum dots

• Полупроводники с флюоресцентными свойствами, могут быть покрыты другими материалами, предотвращающими утечку тяжелых металлов.

Наночастицы могут использоваться для визуализации различных типов клеток in vivo и in vitro

- Использование для оценки органной локализации опухолевых клеток, атеросклеротических бляшек, тромбозов и др.

- Использование для исследования путей миграции вводимых клеток (стволовые кроветворные, мезенхимальные стволовые клетки, дендритные клетки и др.)

- Наночастицы также могут использоваться для стимулирования врождённых механизмов регенерации. Основное внимание здесь сосредоточено на искусственной активации и управлении взрослыми стволовыми клетками.

Наноантитела представляют собой наименьшие из известных на сегодня белковых антиген-узнающих молекул. С наноантителами довольно просто проводить всевозможные генно-инженерные манипуляции: создавать более эффективные комбинированные конструкции, включающие два или несколько наноантител, а также другие белковые домены или функциональные группы. Такие антитела не существуют в организме человека, и поэтому приспосабливания к ним нет.

Биологически активные добавки (БАД) – наноцевтики, нацелены на мощное усиление возможностей организма: от усиления усвояемости активных компонентов пищи и до улучшения умственной деятельности.

В экспериментах на животных наночастицы золота вылечивали рак за счёт атрофии кровеносных сосудов опухоли. Главной целью исследований и являлась остановка этими частицами ангиогенеза в опухолях.

Другое применение наночастиц золота в медицине – так называемая “золотая пуля” – лекарство, поражающее только болезнетворные частицы, и оставляющее нетронутыми клетки хозяина.

Прикрепленную антителами к раковой клетке частицу золота можно нагреть до температуры выше 100ОС, уничтожив саму клетку. Нагрев может и заставить открыться капсулу с противораковым препаратом, который будет доставлен точно к месту назначения.

Для уничтожения паразитов использовались наночастицы золота в комплексе с антителами. Антитело позволяет селективно связываться с мишенью, после чего воздействие лазерного ИК-излучения приводит к перегреву и гибели токсоплазм.

Белки (антитела) приклеиваются к наночастицам и обеспечивают их контакт с опухолью. С использованием золотых стержней длиной примерно 50 нанометров – в тысячи раз меньше толщины человеческого волоса. Антитела прикрепляются к золотым стержням и обеспечивают прилипание золотых частиц к раковым клеткам. Наночастицы позволяют выявить опухоль при помощи существующих фотоакустических методик. Поскольку золотые наночастицы быстро нагреваются при попадании на них инфракрасного света, они могут разрушать опухоли.

Исследователи обнаружили, что наночастицы золота имеют на 600% большее сродство (то есть связывание) с раковыми, чем со здоровыми клетками.

Биочипы - позволяет за короткое время определять несколько тысяч аллергенов, онкогенов, различных биологически активных веществ, и даже генетических дефектов. Технология белковых биочипов, заменяющих целые иммунологические лаборатории, дает возможность в тысячи и десятки тысяч раз увеличить производительность большинства диагностических методов и резко снизить себестоимость анализов.

Биочип представляет из себя матрицу - крохотную пластинку со стороной 5-10 миллиметров, на которую можно нанести до нескольких тысяч различных микротестов. Профессионалы называют этот носитель "платформой". Чаще всего используют стеклянные или пластиковые платформы, на которые наносятся биологические макромолекулы (ДНК, белки, ферменты), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе.

16. Модуль Барназа-барстар. Предложен принципиально новый подход к конструированию мультивалентных рекомбинантных миниантител, обеспечивающих высокоточную доставку действующих агентов к опухолевым тканям. В качестве основы использовано исключительно сильное сродство бактериальной рибонуклеазы барназы и ее природного ингибитора барстара.

Основу конструируемого модуля составили фермент — бактериальная рибонуклеаза (барназа) и её природный ингибитор — белок барстар (модуль барназа:барстар). Благодаря их уникально высокому сродству друг к другу можно создавать сложные и прочные белковые комплексы. Для этого к барназе прикрепляется один элемент запрограммированного соединения, а к барстару — другой.

Впервые с использованием модуля барназа·барстар получены биспецифические мини-антитела одновременно распознающие два разных онкомаркера высокой клинической значимости: рецептор эпидермального ростового фактора человека HER1 (EGFR) и мембранный рецептор HER2/neu.

С помощью модуля барназа–барстар и противораковых гуманизированных анти-HER-2/neu-миниантител сконструированы двух- и трехвалентные олигомерные комплексы, обладающие существенно лучшими свойствами по сравнению с аналогами. Важным преимуществом предложенного подхода по сравнению с известными ранее является строгое соотношение 1:1 партнеров в комплексе, их высокая стабильность и растворимость. Компоненты системы биотехнологичны: каждый из них может быть по отдельности выделен из бактериального продуцента и очищен с помощью аффинной хроматографии. Сформированный двух- или трехвалентный комплекс также может быть легко отделен от исходных компонентов с помощью аффинной хроматографии. Предложенный принцип является универсальным, так как позволяет получать как гомо-, так и гетероолигомерные комплексы и применим не только к миниантителам. . На экспериментальной модели иммунодефицитных мышей с привитыми опухолями человека показано, что двух- и трехвалентные комплексы противораковых миниантител, сконструированные на основе предложенного принципа, обладают лучшими по сравнению с мономерами иммунохимическими и фармакокинетическими характеристиками: мультимерные миниантитела сильнее связываются со своим антигеном, лучше накапливаются в опухолях, быстрее выводятся из почек.

Таким образом, самым перспективным подходом для адресного воздействия на опухолевые ткани на сегодняшний день является применение нового поколения гуманизированных генно-инженерных мини-антител, которые, в отличие от обычно используемых антител животного происхождения, не отторгаются организмом больного человека и не вызывают аллергической реакции.

Исследования адресной доставки антител к опухолям, а также их накопление в здоровых органах и тканях изучалось на модельных животных — иммунодефицитных мышах с привитыми опухолями рака груди и яичника человека (через 24 и 48 часов после введения). У тех мышей, которым вводили противораковое соединение, развитие болезни замедлялось. Нанозолото для диагностики и терапии

Помимо использования квантовых точек, активно развивается ещё одно направление — диагностика с помощью нанозолота, которое присоединяется к молекулярному модулю и доставляется к раковой клетке. Само по себе золото биологически неактивно, так что его наночастицы можно относительно безопасно адресно доставлять к раковым клеткам и накапливать там. При облучении лазером, такие клетки будут нагреваться быстрее, чем клетки окружающих тканей. Известно, однако, что раковые клетки более чувствительны к нагреву, поэтому при определённой температуре (43-45°) в злокачественном образовании должны включатся механизмы самоуничтожения.

В качестве еще одного агента атакующего рак, можно добавить иммунотоксины.

Иммунотоксины — комплексные молекулы, каждая из которых состоит из молекулы специфического антитела и ковалентно связанного с ней токсина. Используются в экспериментальной и клинической онкологии с целью специфической доставки токсина к опухолевым клеткам (токсин выполняет эффекторную функцию, а антитело — антигенраспознающую).

Одними из наиболее перспективных иммунотоксинов, конструируемых для элиминации клеток рака молочной железы (РМЖ), являются химерные белки, содержащие фрагменты терапевтического антитела 4D5 (герцептина, или трастузумаба), направленного к онкогену-маркеру HER-2/neu. Данный маркер, представляющий собой внеклеточный сегмент рецепторного комплекса неустановленной лигандной специфичности, гиперэкспрессирован на клеточной мембране значительной группы опухолей (рак молочной железы, карцинома яичника, легких и др.), что коррелирует с агрессивностью течения заболевания, резистентностью опухоли к химиотерапии и плохим прогнозом. Показано, что инкубация с иммунотоксином способна запускать апоптотические процессы в клетках-мишенях, причем с повышением концентрации иммунотоксина и увеличением времени инкубации уровень апоптоза в клетках возрастает. Совокупность функциональных и структурных данных свидетельствует о способности иммунотоксина scFv4D5-барназа эффективно элиминировать клетки рака молочной железы и о перспективности его дальнейшего исследования как потенциально нового агента для иммунотерапии рака.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что предложенная технология получения надмолекулярных соединений на основе модуля барназа·барстар является универсальной платформой для конструирования нового поколения мультимерных наноантител, нагруженных широким спектром наночастиц – золотых, магнитных, флуоресцентных (квантовые точки) - и предназначенных для разнообразных диагностических и терапевтических приложений.