7. Стадии получения мка и пка

1) Выбор подходов и средств к иммунизации

• Тип АТ (ПКА, МКА) в зависимости от поставленной цели, для которой будут использованы АТ, и теста, в котором они будут применяться

• Выбор животного, продуцирующего АТ ( по размеру – в зависимости от типа получаемых АТ – ПКА или МКА, и необходимого количества АТ. Животное должно быть филогенетически удалено от АГ. Выбирают не только по виду, но и специфические линии. Животные должны быть стерильны, т.е. не инфицированы. Как правило, используют самок, т.к. у них лучше выражен иммунный ответ, особенно в период полового созревания. Используют молодых животных)

• Выбор типа АГ (иммуногена)

• Выбор носителя для гаптена (Носитель должен быть филогенетически удален от иммунизируемого животного, имеет много антигенных детерминант, т.е. и сам является хорошим антигеном и иммуногеном)

2) Подготовка иммуногена

• Определение эпитопов АГ (с помощью специальных программ, тестов)

• Выделение и очистка АГ – для натуральных, естественных, или синтез пептида/гаптена – для искусственных. Антиген должен быть чистым, без примесей, стерильным (фильтрование через поры диаметром 0,22 мкм). Если синтетический пептид, то в нем не должно быть обширных гидрофобных областей, длинных повторов одной а/к (сер, тре, вал), не должен начинаться и заканчиваться на глу, про, асп.

• Сшивка с носителем. Сшивка с носителем химически – с помощью кросс-линкеров. Различные кросс-линкеры используют для сшивки различные группы. Если в качестве АГ используется небольшой пептид, то можно сшить между собой 2 его молекулы с помощью глутарового альдегида. Есть специфические кросс-линкеры, сшивающие аминогруппу одного белка и сульфидную группу другого, т.е. обеспечивают пришивание в определенном положении (сульфо-MSB). Различные кросс-линкеры необходимы для того, чтобы не получить антитела на сам кросс-линкер.

• Контроль качества, стерильности (высевом), токсичности (на культуре клеток). Необходимо убедиться, что АГ свободен от липополисахаридов бактерий, полиакриамидного геля, додецилсульфата натрия, мочевины, других органических примесей, чтобы рН не был экстремальным – если надо, то забуферить.

3) Иммунизация

• Доза

• Периодичность инъекций

• Количество инъекций

• Способ инъекций

• Контроль (отбор проб, титры)

АГ вводится в 2-3-4 приема с интервалами не менее 20 дней (учитывая схему развития иммунного ответа).

Первая инъекция – премирующая – самая высокая доза АГ, используется полный адъювант Фрейнда. Следующие инъекции – бустирующие (поддерживающие) – уменьшается доза, используется неполный адъювант Фрейнда. Перед забором крови для приготовления сыворотки или перед забором селезенки последние терминальные инъекции делаются с интервалом в 1 день, но минимальной дозой.

Способ инъекции зависит от типа АТ (ПКА или МКА). Для МКА – в перитониум, ближе к селезенке (интраперитониально). Для ПКА – подкожно (у кроликов – в лопатку, бедро).

Забор крови для определения титра АТ у кроликов и мышей – из уха.

4) ПКА – забор крови для приготовления сыворотки. У кролика – из уха, у мыши – из хвоста.

МКА – забор селезенки, гибридомная технология.

5) Очистка АТ

ПКА – аффинная хроматография, истощение сыворотки.

МКА – хроматография, высаливание.

6) Контроль качества АТ

• Определение концентрации или титра АТ

• Выявление кросс-реактивности

• Определение изотипа. С помощью ИФА. Получают АТ к различным типам тяжелых и легких цепей. Изотип записывают в паспорт АТ.

• Обычно для МКА эпитопная характеристика – метод взаимодействия с перекрывающимися пептидами.

7) Модификация АТ (метка) осуществляется с помощью кросс-линкеров. Метки: радиоактивные, ферменты, биотин.

8) Хранение

Лиофилизация (высушивание из замороженного состояния) – наилучший способ хранения белка.

Замораживание (-20, -40; -80 – лучшее, т.к. при -80 не действуют протеазы). Модифицированные АТ при замораживании – размораживании могут терять метку, поэтому их хранят при глубоком замораживании с криопротектором.

8. иммунизация. Прививание – в основном 3 раза. BCG. а/г вводиться в 2-3-4 приема с интервалами не менее 20 дней(учитывая схему развития иммунного ответа; чтобы после первого введения развился максимальный, потом сошел на нет).

Подготовка иммуногена. А/г не должен содержать примесей. Рекомбинантные белки- полученные введением чужеродных генов в клетку продуцента. Должен быть стерильным. Белок не должен денатурировать. Эпитоп определили. Необходимо пришить а/г на носитель. Пришивается гаптен химически – кросслинкеры.

Контроль качества, стерильности(высевом), токсичности(на к-ре клеток).