- •1.Антгены и иммуногены. Антигенные детерминанты, эпитопы. Гаптены.
- •3.Антиидиотипические и видоспецифические антитела
- •5. Мка получают с помощью гибридомной технологии, а пка выделяют из сыворотки.
- •6. Методы получения антител
- •7. Стадии получения мка и пка
- •9 Требования к свойствам моноклональных антител:
- •10 Вопрос. Гибридомная технология.
- •12.Рекомбинантные иммунотоксины и иммуноферменты. Иммуноадгезины. Абзимы.
- •13 .Селекция методом фагового дисплея.
- •In vitro и in vivo скрининг библиотек фагового дисплея
- •Вопрос15. Антитела и нанотехнологии.
- •Типы наночастиц
- •17)Трансгенные растения и животные – продуценты антител.
- •18. Классификация методов на основе антител
- •19. Прямые и непрямые иммунохимические методы
- •21. Амплификация сигнала и неспецифическое связывание.
- •23. Способы мечения антител и визуализации комплексов антиген-антитело
- •26)Радиоиммунологические методы.
- •27. Виды ифа. Чувствительность анализа, способы её повышения.
- •29. Ифа. Принцип. Конкурентный и «Сэндвич»-ифа.
- •31. Твердофазные виды ифа. Подбор условий методом «шахматной доски»
- •32. Western-блотинг.Dot-blot. Системы детекции и амплифкации сигнала.
- •33.Метод иммунного блоттинга
- •34.Клеточный ифа. EliSpot. Поляризационный флуороиммуноанализ (пфиа).
- •36.Цитофлюориметрия. Популяционный анализ клеток. Клеточный сортинг.
- •37. Клеточное типирование и селекция клеток. Иммуноцитохимия.
- •38.IgA, IgG, IgM: методы определения, реакция агглютинации
- •40. Флуориметрия и методы на ее основе. Флюоресцентная и конфокальная микроскопия. Локализация антигенов.
- •42. Методы, применяемые в иммунодиагностике
- •43. Фагоциты: исследование функций
- •5. Комплемент, лабораторное исследование функций
- •Иммунные комплексы циркулирующие: методы определения
- •45. Методы выявления клеточных антигенов. Маркеры клеточной активации. Дифференцировочные маркеры лейкоцитов.
- •46.Иммунопрофилактика, иммунотерапия, иммунокорекция, иммуномодуляция. Выбор средств, определение вида и способа иммунокорекции.
- •1. Основные виды иммунокорригирующей терапии
- •2. Выбор средств, определение вида и способа иммунокоррекции
- •48. Оценка фагоцитоза, в- и т-систем иммунитета, активности антителобразующих клеток.
- •49)Иммунопроилактика. Вакцины. Виды вакцин. Способы их получения. Успехи применения вакцинации.
- •50)Иммунодифициты: диагностика и иммунотерапия. Оценка иммунного статуса прииммуннодифицитах.
- •51. Стимуляция пролиферации дендритных клеток. Содействие захвату антигена и его процессингу. Стимуляция ответа эффекторных клеток при помощи прямой презентации антигена.
- •52)Направления имуннотерапии рака. Противораковые вакцины.
- •53.Применение имитаторов опухолевых антигенов. Экстрокорпоральная активация противораковых иммунокомпетентных клеток
- •54.Элиминация раковой опухоли с помощью антител. Ангиостатический подход. Использование цитокинов
- •55. Пробиотики, пищевые волокна.
- •56. Применение иммуномодуляторов при иммунодефицитах.
- •59. Критерии выбора методов для исследования, их применение в биологии, экспериментальной и практической медицине и др. Областях
- •60. Иммунологические подходы и методы, применяемые в медицине
42. Методы, применяемые в иммунодиагностике
Тесты первого порядка – для определения группы диагнозов. Тесты 2, 3 и т.д. порядков – для уточнения диагноза.
Двойная радиальная иммунодиффузия - полуколичественный метод, с помощью которого можно не только выявить антигены, но и оценить степень сходства между ними. Суть метода заключается в следующем:
- в лунки, вырезанные в агаре, вносят исследуемую смесь антигенов и антитела с известной специфичностью (обычно в центральную лунку вносят антитела, а в расположенные вокруг нее - антигены);
- антигены и антитела диффундируют по направлению друг к другу;
- в том месте, где произошло связывание антител и антигенов, образуются полосы преципитации. По взаимному расположению и форме полос преципитации можно оценить степень сходства между антигенами, находящимися в соседних лунках. В настоящее время этот метод применяется в диагностике аутоиммунных заболеваний для выявления аутоантител к экстрагируемым ядерным антигенам. Хотя по чувствительности метод двойной радиальной иммунодиффузии уступает многим количественным методам, технически он прост, не требует высокоочищенных антител, специфичен и может использоваться при проведении массовых исследований.
Простая радиальная иммунодиффузия позволяет количественно определить содержание антигена в исследуемой пробе. Суть метода заключается в следующем. В слое агара, содержащего антитела, вырезают лунки, в одни из которых вносят исследуемый антиген, в другие - стандартный. Антигены диффундируют из лунок в агар, образуя радиальные зоны преципитации. Диаметр зоны преципитации пропорционален концентрации антигена. Это простой и надежный метод количественной оценки иммуноглобулинов (включая подклассы IgG), компонентов комплемента (например, СЗ, С4, фактора В) и других белков сыворотки. Существуют готовые наборы, позволяющие определить антиген в низкой концентрации - не более 3 мкг/мл. Определяя содержание иммуноглобулинов, необходимо учитывать, что изменение их свойств может искажать результаты исследования. Так, если в сыворотке содержатся мономерные IgM (например, при макроглобулинемии Вальденстрема , атаксии-телеангиэктазии ), уровень IgM будет искусственно завышен, поскольку мономерный IgM диффундирует быстрее, чем пентамерный. Присутствие ревматоидного фактора в исследуемой пробе, напротив, искусственно снижает уровень IgG, поскольку иммунные комплексы, состоящие из IgG и ревматоидного фактора, диффундируют медленнее, чем несвязанный IgG. Сыворотка многих больных с дефицитом IgA содержит антитела к белкам животного происхождения, например к козьим иммуноглобулинам, поэтому при использовании козьих антител для определения уровня IgA в этом случае получаются завышенные результаты.
Твердофазный иммуноферментный анализ применяют для количественной оценки антител и антигенов. По чувствительности он сопоставим с радиоиммунным анализом, но более прост, дешев и не требует применения радиоактивных изотопов. Многие лаборатории используют твердофазпый иммуноферментный анализ в качестве стандартного метода определения противовирусных антител, включая антитела к ВИЧ, цитокинов и иммуноглобулинов (IgE и подклассов IgG).
Иммуноблоттинг - качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом:
- смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану;
- мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем - с мечеными антителами к иммуноглобулинам.
Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного иммуноферментного анализа при диагностике ВИЧ- инфекции.
Непрямая иммунофлюоресценция - метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. В качестве источника антигена обычно используют срезы тканей или культуры клеток. Субстрат, перенесенный на предметное стекло, инкубируют в присутствии исследуемой пробы, например сыворотки, а затем - в присутствии меченых флюорохромом антител к иммуноглобулинам. Связанные с субстратом антитела выявляют с помощью флюоресцентного микроскопа. Этот метод обычно применяется для выявления антинуклеарных антител и антител к некоторым вирусам. Хотя метод не является количественным, он достаточно чувствителен и прост.
Гемагглютинация применяется для выявления антител к тиреоглобулину и микросомальным антителам, латекс-агглютинация - для выявления ревматоидного фактора и некоторых других антител. Эти методы просты и позволяют количественно определить антиген, однако менее чувствительны, чем радиоимунный и твердофазный иммуноферментный анализы.
Определение общего уровня IgE обычно проводят с помощью радиоиммунного анализа , поскольку низкое содержание этого иммуноглобулина не позволяет использовать те методы, которые применяются для определения IgG, IgA и IgM.
Количественную оценку IgE проводят таким образом:
- исследованную пробу добавляют к сорбированным на твердой подложке антителам против IgE;
- после отмывания от несвязанного IgE добавляют меченные изотопом антитела к IgE;
- после отмывания от несвязанных антител по уровню радиоактивности определяют количество IgE в исследуемой пробе.
Определение специфических IgE обычно проводят с помощью кожных проб. Определение специальных IgE с помощью радиоаллергосорбенного теста показано при высоком риске анафилактических реакций, пораженной кожи и проведения лечения, влияющего на результаты кожных проб. Суть метода заключается в следующем:
- к аллергену, сорбированному на твердой подложке, добавляют исследованную сыворотку;
- после отмывания не связавшихся IgE добавляют меченые тела к IgE;
- по уровню радиоактивности определяют содержание специфических IgE в исследованной пробе.
Применяется модификация метода с использованием меченых ферментов антител к IgE.
Методы, основанные на реакции высвобождения гистамина тучными клетками. Суть методов заключается в следующем:
- к тучным клеткам, покрытым специфическим IgE, добавляют антиген;
- связывание антигена с IgE вызывает дегрануляцию тучных клеток и высвобождение гистамина;
- определяют содержание гистамина в растворе.
Одной из разновидностей реакций гемагглютинации является реакция Кумбса, применяемая для выявления неполных антител. Как уже упоминалось ранее, такие антитела закрепляются на поверхности эритроцитов естественным образом, поэтому если смешать суспензию эритроцитов с антителами, комплементарными изотипическим антигенным детерминантам иммуноглобулинов определенного класса (антииммуноглобулинами), будет происходить их агрегирование. Такой вариант реакции Кумбса называется прямым и применяется для выявления уже сорбированных неполных антител. Для выявления неполных антител в плазме крови смешивают взятую от пациента сыворотку и суспензию эритроцитов другого организма, выдерживают необходимое для адсорбции неполных антител время и добавляют антииммуноглобулины. Такой тест называется непрямой реакцией Кумбса. Реакции выявления неполных антител проводят при ряде неинфекционных (гемолитическая анемия, желтуха новорожденных и др.) заболеваний и некоторых инфекционных (бруцеллезе, туляремии и др.) болезнях.
Примером реакции, в которой используются комплемент и эритроциты, является реакция связывания комплемента (сокращенно РСК). Наибольшую известность получило применение этой реакции в диагностике сифилиса, поскольку выявлять образующиеся в малых количествах в организме болеющих антитела против возбудителя этой болезни методами преципитации или агглютинации не удавалось. В настоящее время существует еще несколько серологических методов диагностики сифилиса, но РСК не утратила своего значения до сих пор. Для постановки этой реакции принято готовить две системы. Система I представляет смесь диагностикума, содержащего антигены Treponema pallidum (возбудителя сифилиса), прогретой до 57˚С в течение 30 мин исследуемой сыворотки (прогревание необходимо для инактивации комплемента человека в сыворотке) и раствор комплемента (чаще всего морской свинки) в строго определенном количестве (так называемый оттитрованный комплемент). Параллельно готовят систему II (гемолитическую систему), которая содержит 3 % взвесь отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана и сыворотку кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Все компоненты обоих систем, кроме эритроцитов и анализируемой сыворотки, производятся промышленно и поставляются в лаборатории в лиофилизированном состоянии. Для проверки качества используемых растворов и условий проведения реакции каждый раз готовят контроли: 1) диагностикума – диагностикум + комплемент + физиологический раствор (вместо сыворотки), 2) комплемента – раствор комплемента + двойной объем физиологического раствора, 3) исследуемой сыворотки – сыворотка + комплемент + физиологический раствор (вместо диагностикума), 4) заведомо положительный контроль – стандартная иммунная сыворотка против антигенов Treponema pallidum + диагностикум + комплемент, 5) заведомо отрицательный – сыворотка здорового человека + диагностикум + комплемент. После инкубирования системы I, системы II и всех контролей в течение 45 мин при 37˚С во все пробирки доливают двойной объем системы II и продолжают инкубирование при этой же температуре до полного гемолиза в контрольных пробирках 1–4 (обычно 30–40 мин). Если в опытной пробирке имеет место гемолиз – раствор становится красным и прозрачным (так называемая «лаковая кровь»), результат реакции считается отрицательным. Если эритроциты не лизируются, а оседают на дно (раствор становится прозрачным, но бесцветным) – положительным. Суть такого прочтения результатов заключается в следующем. При наличии в исследуемой сыворотке антител к антигенам диагностикума активация комплемента происходит еще в первой системе, и он, будучи добавлен в ограниченном количестве, израсходуется. При отсутствии таких антител антиген сохраняется в исходном количестве и фактически переходит в систему II, где активируется на поверхности покрытых антителами кролика эритроцитов барана, что и приводит к их гемолизу и выходу гемоглобина в раствор.