36.Цитофлюориметрия. Популяционный анализ клеток. Клеточный сортинг.

Проточная цитофлюориметрия — это метод идентификации клеток иммунной системы, а также микроорганизмов, основанный на лазерной рестрикции специфических к маркерам клеток флуоресцирующих антител при прохождении клеток через капилляр.

позволяет измерять интенсивность флуоресценции и рассеяния света от частиц, проходящих по одной, в потоке жидкости через измерительную ячейку. Поскольку частицы (чаще всего клетки) анализируются по одной, в результате измерения имеется не только среднее значение параметра, но и его распределение в популяции. используется в иммунологии, онкологии, цитологии, гематологии, фармакологии и медицинской диагностике:

• при исследовании иммунного статуса (иммунофентипирование лимфоцитов)

• при иммунофенотипировании клеток периферической крови

• для определения фагоцитарной активности

• для определения внутриклеточных цитокинов

• для оценки функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток

• в диагностике гемобластозов, и других заболеваний.

• для контроля приживления трансплантата и эффективностью иммунотерапии

• для анализа ДНК при исследовании клеточного цикла, и т. д.

Определение поверхностных антигенов лимфоцитов CD широко применяется при обследовании ВИЧ-инфицированных.

Устройство и принцип работы цитофлуориметр

Проточный цитофлюориметр – это прибор, позволяющий быстро оценить состав клеточной популяции по флюоресценции и оптическим характеристикам клеток. С помощью этого прибора можно определить абсолютное и относительное число клеток разных популяций и субпопуляций. Цитофлуориметр позволяет анализировать как фиксированные, так и живые клетки диаметром от 0,5 мкм до 40 мкм. Система для проточной цитофлюориметрии состоит из следующих основных устройств: цитометр и управляющий компьютер. Система подачи жидкостей – важный компонент цитометра. Она осуществляет подачу образца в измерительную ячейку таким образом, что частицы суспензии проходят через центральную зону лазерного луча (область с максимальной интенсивностью света) строго по одной.

Принцип работы:

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. При этом минимальный объем образца должен составлять 0,5 мл. Необходимо следить за объемом образца, поскольку попадание пузырьков воздуха в проточную ячейку приведет к искажению потоков жидкостей, закупорке ее, и в итоге к искажению результатов. Образец должен представлять собой суспензию единичных частиц (клеток) без агрегатов во избежание получения неверных результатов или закупорки проточной ячейки. Оптимальная плотность суспензии – 10⁶ в 1 мл.

В момент пересечения клеткой лазерного луча (точка детекции) детекторы фиксируют:

• рассеяние света под малыми углами (от1°до 10°) (для определения размеров клеток).

• рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).

• интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20) – позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др. К основным преимуществам метода относятся быстрота анализа и возможность одновременной оценки многих параметров клетки; размера, оптической плотности, поверхностных антигенов. Проточная цитофлюориметрия применяется также для анализа ДНК при исследовании клеточного цикла. В большинстве клинических лабораторий для определения поверхностных антигенов лимфоцитов используют цельную кровь. Суть метода заключается в следующем: - к небольшому объему цельной крови добавляют меченные флюорохромом моноклональные антитела; - после инкубации, необходимой для связывания антител с антигенами клеточной поверхности, разрушают эритроциты; - с помощью проточного цитофлюориметра анализируют клеточный состав пробы. Результаты исследования выражают в виде абсолютного и относительного числа лимфоцитов разных популяций. Оценку результатов проводят с учетом нормальных показателей, которые зависят от возраста, пола и расы. Простой способ проверки надежности результатов заключается в том, что относительное содержание основных популяций лимфоцитов (Т-, В- и NK-лимфоцитов) в сумме должно составлять 100%.

Популяц-й анализ – позволяет оценить кл. попул. по флюр. и оптич. хар-кам кл.; абс. и относ. число кл. разных попул. и суб. попул.

Иммунофлюоресценция позволила разработать уникальный по своим возможностям метод отбора нужных клеток из смешанных суспензий (ил. 57). Такую суспензию (например, фракцию лейкоцитов крови чело­века) подвергают обработке иммуноглобулинами двух разных типов: од­ни из них комплементарны специфическому антигенному маркеру кле­ток определенной группы (например, Т-клеток) и мечены дающим при возбуждении зеленый свет флюорохромом, вторые - маркеру другой группы (например, В-лимфоцитов) и мечены флюорохромом, испускаю­щим при возбуждении той же длиной волны красный свет. Затем смесь помещают в прибор FACS (от англ. fluorescence activated cell sorter), ко­торый в русскоязычном варианте чаще всего называют «лазерный про­точный цитометр». Клетки в тонкой струе жидкости по одной пропуска­ются через луч лазера с длиной волны, возбуждающей свечение в конъ-югированных с антителами флюорохромах. Сложная оптическая система прибора регистрирует сразу несколько параметров прошедшей через луч клетки: ее размеры, наличие цитоплазматических гранул и испускаемый свет. В зависимости от информации, поступившей из оптического блока в механический блок, сепаратор направит клетку с определенными ха­рактеристиками в нужный сосуд. Одновременно связанная с прибором компьютерная система регистрирует, сколько и каких клеток было про­анализировано, что позволяет кроме сортировки получить количествен­ные данные о составе изучаемой суспензии.

Недостатками реакций иммунофлюоресценции является

невозможность их применения к объектам, молекулы которых могут флюоресцировать, и невысокая точность определения количеств анализируемых антигенов.