17)Трансгенные растения и животные – продуценты антител.

Трансгенные организмы – это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генетическая информация (трансген). Трансген – это искусственно введенный и интегрировавшийся в ДНК животных чужеродный ген. Молекулярно-генетические аспекты в создании и использовании трансгенных животных

Генетическое совершенствование животных базируется, главным образом, на мутационной изменчивости, а также комбинационной изменчивости, реализуемой при скрещивании различных пород и популяций животных.

Среди большого разнообразия способов внедрения экзогенной ДНК в геном индивидуумов можно выделить следующие, которые нашли широкое применение в практике трансгенеза:

метод микроинъекции

опосредованный ретровирусами перенос генов

перенос трансформированных ядер генеративных и соматических клеток

перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом.

Наиболее широко используемым методом трансгенеза в животноводстве является метод микроинъекции, суть которого заключается во введении раствора генных конструкций в мужской пронуклеус зигот.

Результативным способом переноса ДНК в эмбриональные линии животных является применение так называемых ретровирусных векторов.

Еще одним способом получения трансгенных млекопитающих является использование трансформированных генными конструкциями клеточных линий. С этой целью могут быть использованы как полипотентные стволовые клеточные линии, так и соматические клетки, культивируемые in vitro. Преимуществом получения трансгенных животных с помощью трансформированных стволовых клеток является возможность тестирования интеграции трансгена в культуре клеток. Еще один способ получения трансгенных животных является перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом. Большинство трансгенов представляют собой кДНК, небольшие гены или фраг­менты генов. Зачастую кДНК плохо экспрссируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последователь­ности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные компле­ксы слишком велики для встраи­вания в обычные векторы.

Создание мышей, которые синтезировали бы только человеческие антитела, — это примеча­тельный пример трансгеноза с помощью YAC. Моноклональные антите­ла можно использовать для лечения некоторых заболеваний человека. Однако получить челове­ческие моноклональные антитела практически невозможно.

Первые трансгенные сельскохозяйственные животные были получены в России в 1987 году: Эрнст Л.К. с соавторами [1987] сообщили о создании трансгенных кроликов, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека. Год спустя были созданы кролики с интеграцией генов соматотропина человека, антисмысловой РНК против аденовируса Adh5.

Исследования проводятся российскими учеными в двух основных направлениях: разработка и совершенствование способов и приемов введения экзогенной ДНК в эмбриональные и соматические клетки сельскохозяйственных животных и использование существующих технологий для создания трансгенных сельскохозяйственных животных для медицины, ветеринарии и других потребностей человека.

Экспрессия генетического материала в трансгенных растениях.

Растения являются удобной, безопасной и экономически выгодной альтернативой для продукции различных белков, вакцин и антител по сравнению с системами экспрессии на основе микроорганизмов, культур животных клеток или трансгенных животных.

В клетках высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность рекомбинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний и широкого терапевтического использования. В отличие от животных, растительные клетки не содержат в своём составе патогенные для человека вирусы, а также прионы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных белков медицинского назначения. В дополнение ко всему перенос фрагментов экзогенной ДНК в растительный геном и регенерация у растений происходят значительно проще по сравнению с животными.

Первым из них был предложен путь использования трансгенных растений, в ядерный геном которых перенесены гены, контролирующие синтез соответствующих гетерологичных белков. Получение таких растений было основано на природной способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей собственной ДНК в виде Т-области мегаплазмиды в растительные клетки. Именно эта часть Ti-плазмиды была использована учёными для переноса генно-инженерных конструкций, включающих различные целевые гены. Были разработаны методы прямой доставки чужеродных генов в растительный геном, такие, как микроинъекции, электропорация и методы биобаллистики. В этом случае для переноса использовалась очищенная плазмидная ДНК, в которой содержались генетические конструкции с целевыми генами.

Третий путь использования растений для накопления белков гетерологичного происхождения основан на природной способности растительных вирусов проникать в клетки растений и колонизировать растительные ткани. Для заражения растительных тканей используются рекомбинантные (+)РНК-содержащие вирусы растений, несущие в составе своего генома транскрипт чужеродного гена. Продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений.

Кроме полноразмерных иммуноглобулинов в растениях успешно синтезированы разные их производные: Fab-фрагменты, одноцепочечные вариабельные фрагменты, биспецифичные вариабельные фрагменты.

Антитела, полученные в растениях, могут быть одними из первых фармакологических белков, нарабатываемых в промышленных масштабах. Во многих исследованиях антитела получают в семенах злаковых и бобовых растений, что дает преимущество при их долговременном хранении при обычной температуре без потери активности. Из многих бобовых только горох и соя используются в настоящее время в качестве продуцентов рекомбинантных белков. Описан синтез человеческих антител к вирусу генитального герпеса в листьях и семенах сои.

Моноклональные антитела, экспрессированные в сое – антитела против генитального герпеса, могут также быть внедрены в производство. Эти антитела, несмотря на различие в гликозилировании, защищали мышей от вируса герпеса типа 2 так же хорошо, как и антитела, синтезированные в культуре клеток человека. Еще одни антитела, прошедшие фазу I клинических испытаний – scFv-антитела против лимфомы.

Трансгенные растения рассматриваются как потенциальный недорогой источник иммуноглобулинов для медицинских и исследовательских целей.