2. Фіксовані забарвлені препарати

Нижче приведені етапи приготування препарата.

2.1. Приготування мазка. На предметне скло наносять краплю водопроводної води, вносять в неї невелику кількість досліджуваного мате­ріалу, взятого з густого живлячого середовища бактеріальною петлею ірозмішують (у разі вирощування бактерій на рідкому середовищі на скло наносять лише краплю мікробної суспензії), мікробну суміш роз­мазують петлею на площі 2 -3 см² тонким шаром.

2.2.Фіксація мазка. Мазок висушують на повітрі або в струмені теп­лого повітря над полум'ям спиртівки, держачи скло мазком догори. Охолоджений мазок фіксують в полум'ї спиртівки: скло з мазком, обер­неним догори, проводять 3-4 рази через полум'я. При цьому мікроби гинуть, клітини прикріплюються до скла і поліпшується їх фарбування.

Можлива також фіксація хімічним шляхом (етиловим, метиловим спиртами, сумішшю рівних об'ємів спирту з ефіром і інш.).

Фіксовані препарати мікроскопувати лише після їх фарбування спеціальними барвниками.

2.3.Фарбування мікроорганізмів. Для фарбування мікроорганізмів ви­користовують анілінові барвники (основні, кислі і нейтральні). Най­частіше використовують основні барвники - метиленовий синій, основ­ний фуксин, генціановий фіолетовий і інші; для фарбування препа­ратів готують спиртові, водні і водно-спиртові розчини, інколи до­дають у якості протрави фенол або луги.

Фарбування мікроорганізмів - складний фізико-хімічний процес, який здійснюється завдяки механізмів електроадсорбції, капілярності, хімічній взаємодії між барвником і об'єктом. Основні барвники скла­даються з забарвленого катіону і безбарвного аніону. Оскільки бак­терії володіють поверхневим від'ємним зарядом і в них містяться спо­луки кислої природи (нуклеїнові кислоти), основні барвники характе­ризуються великим спорідненням з клітинами, що забезпечує їм широке використання.

Деякі барвники характеризуються вибірковою хімічною спорідненістю з окремими компонентами клітини (ядерній речовині, включен­ням) і застосовуються для їх виявлення. Так, зерна волютину добре фарбуються хрізоідином, метиленовим синім, зерна гранулези і гліко­гену - розчином іоду, зерна жиру – суданом ІІІ. Здатність мікроорга­нізмів до забарвлення називається тинкториальною властивістю.

Фіксовані нефарбовані препарати мають ряд переваг перед при­життєвими, а саме: високу контрасність; здатність диференцьованого виявлення клітинних структур; безпечність роботи, тривалість збере­ження препарату.

Метод дослідження забарвлених препаратів використовується при якісних і кількісних дослідженнях мікробіологічних об'єктів.

2.3.1.Фарбування по методу Грама. Фарбування бактерій по методу Грама є диференціальним і широко використовується для визначення їх видової приналежності. По здат­ності забарвлюватися по методу Грама всі бактерії діляться на дві групи: грампозитивні (гр +) і грамнегативні (гр -). Грампозитивні бактерії здатні утримувати комплекс барвника генціанового фіолето­вого з іодом при обробці спиртом і тому забарвлюються у фіолетовий колір; грамнегативні бактерії не володіють такою здатністю і зне­барвлюються спиртом. При подальшій обробці фуксином вони набувають червоний колір.

Техніка фарбування по Граму (в модифікації Сінева) складаєть­ся з наступних етапів:

І) на фіксований мазок кладуть сухий фільтрувальний папір, про­сочений генціановим фіолетовим, потім наносять на папір 2-3 краплі води і фарбують 2 хвилини;

2) знімають папір і, не промиваючи препарат водою, наносять на мазок 2-3 краплі розчину Люголя, витримують реактив 1- 2 хвилини;

3) зливають розчин Люголя і для знебарвлення наносять на мазок 96% етиловий спирт на 30 сек.;

4) промивають препарат водою;

5) для додаткового забарвлення наливають на мазок водний роз­чин фуксину на 1 хвилину;

6) промивають препарат водою, промокають фільтрувальним папером і мікроскопують з імерсійним об'ективом.

Бактерії, які забарвлені в синій колір, відносяться до грампозитивних, в червоний - до грамнегативних.

Матеріали та обладнання: 1) мікроскопи; 2) пред­метні та накривні скельця; 3) бактеріологічні петлі; 4) скляні палички; 5) спиртівки; 6) препарувальні голки; 7) кедрова олія; 8) розчин фарб метиленової синьки, фуксину тощо; 9) сінна настойка та інші мікробні культури.

Проведення роботи. 1) чисте предметне скло взяти пальцями за ребро, прожарити в полум'ї спиртівки для знежирення і охолодити, відібрати з пробірки бактеріальною петлею краплю суспензії бактерій, нанести її на пред­метне скло і розтерти обережними рухами на поверхні діаметром при­близно 1-1,5 см, висушити на повітрі; мазок повинен бути тонким, рівномірно розтертим, невеликим;

2) зафіксувати препарат у полум'я спиртівки як вказано вище. Охолодити на повітрі;

3) пофарбувати препарат по Граму, користуючись вищеописаною методикою;

4) дослідити препарат під мікроскопом при великому збільшенні об’єктів (90^х).

При фарбуванні по Граму можливі наступні помилки:

- всі клітини сині від недостатнього знебарвлення;

- всі клітини блідо-рожеві внаслідок недостатнього забарвлення генціаном (багато води на папері) або надмірної обробки спиртом;

- рідкі клітини в полі зору - погано збовтана завись мікробів у пробірці або невдало вибране поле зору.

Переглядають і замальовують демонстраційні мікроскопічні препа­рати бактерій різних видів, пофарбованих по Граму, відмічають шаровидну форму бактерій, названих коками, паличковидну форму бактерій, наявність спор у вигляді непофарбованих діля­нок в клітинах спорових бактерій, завиту форму бактерій, названих вібріонами і спірилами. Звертають увагу на рівномірне забарвлення клітин бактерій по способу Грама, що не дає виявити внутрішню будову клітин при даному способі фарбування.

В протоколі занять повинні бути: запис правил роботи з біологічним імерсійним мікроскопом; запис методики фарбування по Граму; малюнки препаратів, забарвлених по Граму; малюнки демон­страційних препаратів з відміткою про особливості клітин, які спосте­рігалися. Наприклад, у препапараті спостерігалося два види клітин: шаровидні, забарвлені в синій колір і паличковидні - в червоний колір. Висновок: коки - гр +; палички - гр -.

Запитання до лабораторної роботи 3

1. На які царства поділяють мікроорганізми?

2. В чому особливість будови прокаріотних клітин?

3. В чому полягає особливість будови еукаріотичних клітин?

4. Яка будова вірусів?

5. Який механізм проникнення вірусів у клітину?

6. Що таке бактеріофаги?

7. Опишіть морфологію бактеріальної клітини (форма, спори, джугики).

8. Які методи дослідження морфології бактерій вам відомі?

9. Які існують способи фіксації бактеріальних препаратів?

10. У чому полягають задачі прижиттєвої мікроскопії мікробів? Які переваги і недоліки цього методу?

11. Які задачі мікроскопії фіксованих забарвлених препаратів мікро­організмів? Які переваги і недоліки цього способу?

12. Яке призначення фарбування по Граму?

13. Опишіть методику фарбування по Граму.

14. Які групи клітин можуть утворювати шаровидні бактерії і як вони називаються?

15. Які бактерії утворюють спори?

16. Як визначають спори у клітинах?