- •1. Введение
- •2. Основные термины и определения
- •3. Роль регуляторных механизмов в поддержании клеточного гомеостаза
- •4. Типы регуляции
- •5. Практическое использование знаний об основах регуляции метаболизма у микроорганизмов
- •1. Способ регуляции метаболических процессов, основанный на избирательном синтезе ферментов
- •2. Регуляция репликации днк
- •3. Регуляция процесса транскрипции. Механизмы индукции и репрессии
- •4. Другие механизмы регуляции транскрипции у микроорганизмов
- •1. Избирательный синтез ферментов за счет регуляции процесса трансляции у микроорганизмов
- •2. Биосинтез и сборка компонентов аппарата трансляции
- •3. Регуляция функционирования аппарата трансляции
- •4. Способы регуляции биосинтеза и круговорота белков у микроорганизмов путем посттрансляционной модификации и избирательного протеолиза
- •1. Способ регуляции метаболических процессов у микроорганизмов, основанный на изменении активности ферментов
- •2. Простые и регуляторные ферменты
- •3. Аллостерические ферменты и эффекторы
- •4. Гомотропная и гетеротропная кооперативность
- •5. Обратимая ковалентная модификация
- •1. Специфические механизмы регуляции активности ферментов у микроорганизмов. Регуляция путей биосинтеза и промежуточного обмена
- •2. Роль энергетического заряда в регуляции клеточного метаболизма
- •3. Регуляторные эффекты Пастера и Крэбтри
- •4. Регуляция метаболической активности за счёт компартментализации ферментов и их взаимодействия с клеточными мембранами
- •1. Пассивная проницаемость и транспортные функции цитоплазматической мембраны бактерий
- •2. Энергетика транспортных процессов у микроорганизмов
- •3. Организация и регуляция транспортных процессов на уровне биосинтеза. Сборка и функционирование компонентов транспортных систем
- •1. Общая характеристика процесса клеточного деления
- •2. Накопление критической клеточной массы и репликация днк генома
- •3. Построение клеточной оболочки и перегородки
- •4. Взаимоотношение репликации днк и сборки клеточной перегородки
- •1. Скорость метаболизма в процессе клеточного деления
- •2. Выявление «узких мест» в метаболизме микробной клетки
- •3. Связь скорости роста микроорганизмов с биосинтезом стабильных форм рнк
- •4. Взаимосвязь регуляторных механизмов и их реализация в развивающихся микробных клетках
- •5. Регуляция межклеточных взаимодействий
- •1. Общая характеристика методологических подходов к решению научных проблем регуляции метаболизма микробных клеток
- •2. Классификация методов изучения регуляции метаболической активности
- •3. Методические особенности изучения скорости роста и активности транспортных систем у микроорганизмов
- •4. Методы изучения регуляции клеточного метаболизма с использованием мутантных микроорганизмов
- •Практика
- •Вводная часть
- •Основные термины и определения
- •1 Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2 Изучение метаболической активности микроорганизмов. Общая характеристика условий эксперимента
1.1.2 Покоящиеся клетки
Рост клеток можно остановить, если отделить их (путем центрифугирования или фильтрации) от питательной среды и суспендировать в «нейтральной», осмотически подходящей среде, например забуференном физиологическом растворе или минерально-солевой среде, лишенной источников углерода и азота. Обработанные таким образом клетки называются покоящимися. Они обладают тем же набором ферментов, что и растущие клетки, но находятся в относительно неактивном состоянии. На таких клетках можно изучать реакции или группы реакций, представляющие особый интерес. Кроме того, покоящиеся клетки служат объектом при изучении транспортных процессов, включая транслокацию субстратов и ионов.
1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
Бывают случаи, когда клетки полностью лишают эндогенных источников энергии. Прекрасный пример использования голодающих покоящихся клеток - измерение внутриклеточного АТФ, образующегося за счет хемиосмотического мембранного потенциала. В неголодающих клетках выявление АТФ, синтезированного за счет хемиосмотического градиента, затруднительно из-за высокого фонового уровня АТФ. Методика голодания для Е. coli была разработана Кохом.
Более обычный способ подавления эндогенного метаболизма, по крайней мере у аэробов или факультативных аэробов, заключается просто в энергичном аэрировании густой суспензии клеток (в основной среде или буфере) в течение 2-4 ч или дольше, если это необходимо. За сокращением запасов питательных веществ в клетках можно следить, измеряя максимальное снижение эндогенного дыхания Q (O2) относительно уровня Q (O2), необходимого для окисления какого-либо субстрата, например глюкозы.
1.2 Проницаемость клеток
Работа с интактными клетками имеет свои трудности. Главная трудность заключается в том, что как растущие, так и покоящиеся клетки непроницаемы для большинства субстратов, кофакторов и метаболитов, обычно используемых при определении ферментов. Принято считать, что лучше всего изучать ферментативные реакции в условиях, когда белок-белковые (или белок-мембранные) взаимодействия между молекулами одного фермента (гомологичные взаимодействия) или между молекулой данного фермента и молекулой другого белка (гетерологичные взаимодействия) подобны тем, которые существуют in situ. Хотя при использовании интактных клеток данное условие выполняется, это малоутешительно, если необходимые субстраты не могут проникать через клеточную мембрану.
1.2.1 Обработка растворителями
Существует ряд методик, позволяющих более или менее успешно делать целые клетки более проницаемыми и тем самым использовать их для исследования ферментов. Например, при обработке клеток Е. coli растворителями (толуолом или бензолом) они становятся проницаемыми для -галактозидов, которые проникают в клетки и подвергаются гидролизу -галактозидазой.
1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
Обработка энтеробактерий хелатобразующим агентом (трис-ЭДТА) была успешно применена для того, чтобы сделать их проницаемыми и, следовательно, чувствительными к актиномицину D. Более того, везде, где это возможно, следует сравнивать ферментативные активности обработанных и интактных клеток.