- •1. Введение
- •2. Основные термины и определения
- •3. Роль регуляторных механизмов в поддержании клеточного гомеостаза
- •4. Типы регуляции
- •5. Практическое использование знаний об основах регуляции метаболизма у микроорганизмов
- •1. Способ регуляции метаболических процессов, основанный на избирательном синтезе ферментов
- •2. Регуляция репликации днк
- •3. Регуляция процесса транскрипции. Механизмы индукции и репрессии
- •4. Другие механизмы регуляции транскрипции у микроорганизмов
- •1. Избирательный синтез ферментов за счет регуляции процесса трансляции у микроорганизмов
- •2. Биосинтез и сборка компонентов аппарата трансляции
- •3. Регуляция функционирования аппарата трансляции
- •4. Способы регуляции биосинтеза и круговорота белков у микроорганизмов путем посттрансляционной модификации и избирательного протеолиза
- •1. Способ регуляции метаболических процессов у микроорганизмов, основанный на изменении активности ферментов
- •2. Простые и регуляторные ферменты
- •3. Аллостерические ферменты и эффекторы
- •4. Гомотропная и гетеротропная кооперативность
- •5. Обратимая ковалентная модификация
- •1. Специфические механизмы регуляции активности ферментов у микроорганизмов. Регуляция путей биосинтеза и промежуточного обмена
- •2. Роль энергетического заряда в регуляции клеточного метаболизма
- •3. Регуляторные эффекты Пастера и Крэбтри
- •4. Регуляция метаболической активности за счёт компартментализации ферментов и их взаимодействия с клеточными мембранами
- •1. Пассивная проницаемость и транспортные функции цитоплазматической мембраны бактерий
- •2. Энергетика транспортных процессов у микроорганизмов
- •3. Организация и регуляция транспортных процессов на уровне биосинтеза. Сборка и функционирование компонентов транспортных систем
- •1. Общая характеристика процесса клеточного деления
- •2. Накопление критической клеточной массы и репликация днк генома
- •3. Построение клеточной оболочки и перегородки
- •4. Взаимоотношение репликации днк и сборки клеточной перегородки
- •1. Скорость метаболизма в процессе клеточного деления
- •2. Выявление «узких мест» в метаболизме микробной клетки
- •3. Связь скорости роста микроорганизмов с биосинтезом стабильных форм рнк
- •4. Взаимосвязь регуляторных механизмов и их реализация в развивающихся микробных клетках
- •5. Регуляция межклеточных взаимодействий
- •1. Общая характеристика методологических подходов к решению научных проблем регуляции метаболизма микробных клеток
- •2. Классификация методов изучения регуляции метаболической активности
- •3. Методические особенности изучения скорости роста и активности транспортных систем у микроорганизмов
- •4. Методы изучения регуляции клеточного метаболизма с использованием мутантных микроорганизмов
- •Практика
- •Вводная часть
- •Основные термины и определения
- •1 Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2 Изучение метаболической активности микроорганизмов. Общая характеристика условий эксперимента
1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
Во многих случаях целые клетки, как проницаемые, так и непроницаемые, бывают непригодны или слишком сложны для исследований, и тогда приходится прибегать к дезинтегрированным клеточным препаратам.
Впервые работа с использованием таких препаратов в качестве источника ферментов была опубликована в 1897 г. Бюхнером. Эксперименты Бюхнера называют «одними из основополагающих экспериментов в современной биохимии, стоящими в одном ряду с опытами Лавуазье в химии».
1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
Бактериальные клетки разрушают различными способами. Самым мягким из всех механических способов разрушения клеток является разрушение клеточной мембраны под действием гидростатического (осмотического) давления.
Применение осмотического шока оказывается очень полезным при изучении некоторых ферментов грамотрицательных бактерий. Эти ферменты локализуются между плазматической мембраной и наружными слоями клеточной стенки в периплазматическом пространстве, и поэтому их называют «периплазматическими» ферментами. Обычно это гидролазы, такие, как щелочная фосфатаза, рибонуклеаза I и циклическая фосфодиэстераза.
Одним из способов быстрого и мягкого лизиса грамотрицательных клеток является обработка смесью лизоцим – ЭДТА.
Мягкая осмотическая обработка применяется также при выделении протопластов и мембранных везикул грамположительных бактерий. Выделенные с ее помощью препараты используют при изучении транспорта веществ через бактериальную мембрану.
1.3.2 Дезинтеграция
Пресс Френча. Пресс Френча - очень эффективное устройство для разрушения клеток многих видов микроорганизмов. В продаже имеется много вариантов этого устройства. Простейшее из них состоит из камеры, помещенной в лабораторный гидравлический пресс, способный создавать общее давление 10-20 т. В камеру вносят клеточную суспензию, которую подвергают действию поршня. Клетки эффективно разрушаются при выходе суспензии под давлением из маленького отверстия камеры. Одной рукой можно регулировать давление гидравлического пресса, а другой скорость выталкивания клеток через игольчатый клапан. В продаже имеется устройство с автоматическим гидравлическим прессом.
Этим методом можно разрушать большинство бактерий, даже те, которые разрушаются особенно трудно, например микобактерии. Суспензию грамотрицательных кокков часто требуется пропускать через пресс повторно. Помимо того что этот способ разрушения очень удобен и эффективен, он имеет еще одно достоинство: при его использовании инактивация ферментов минимальна.
Вибрационные мельницы. К суспензии клеток добавляют мелкие стеклянные шарики и смесь помещают в стеклянную или металлическую капсулу, поставляемую фирмой-изготовителем. Для оптимального разрушения эмпирически подбирают соотношение объемов шариков и клеток, которое обычно равно 1:1. Объемы смеси, как правило, не превышают 25 мл.
Обработка ультразвуком. Разрушение клеток ультразвуком обусловлено кавитационными силами, создающими ударные волны или кавитационный микропоток, что способствует химической атаке свободными радикалами. Каким бы ни был механизм дезинтеграции, ультразвуковая обработка - очень эффективное средство разрушения бактериальных клеток. По мере выхода крупных молекул, например ДНК, суспензия становится более вязкой и разрушение клеток ухудшается. Более разбавленные клеточные суспензии быстрее разрушаются ультразвуком. Время обработки обычно определяют эмпирически, учитывая необходимость отвода выделяющегося тепла, а также чувствительность ферментов к инактивации.
По-видимому, ультразвуковая обработка - наиболее быстрый и легкий способ разрушения клеток. Еще одно его достоинство заключается в том, что с его помощью эффективно разрушаются самые различные бактерии. Все это позволяет широко применять этот способ в бактериологических исследованиях. Растирание клеток с окисью алюминия. Это один из наиболее дешевых способов разрушения бактерий. Для него необходимы лишь ступка, пестик и порошок окиси алюминия. Окись алюминия промывают и высушивают при 100°С. Замороженный (или охлажденный) осадок клеток помещают в охлажденную ступку. Соотношение охлажденной окиси алюминия и клеточной массы - 1:2 (по весу). Энергично растирают смесь 2-5 мин. За это время порошкообразная смесь превращается в липкую, клееобразную массу, что свидетельствует о разрушении клеток. Добавляют соответствующий буфер, ресуспендируют содержимое ступки и центрифугируют его для удаления окиси алюминия и неразрушенных клеток. Этим способом можно быстро разрушить относительно большое количество клеток. Большинство бактерий, однако, эффективнее разрушается другими методами.
Пресс Хьюза. Пресс Хьюза состоит из устройства для пропускания замороженной клеточной суспензии или пасты из клеток (с добавлением абразивного материала, например равного объема пирексового стеклянного порошка, или без него) через небольшое отверстие в приемную камеру. Суспензию пропускают под высоким давлением (6,8107 - 54,4107 Па), создаваемым гидравлическим прессом. Существует несколько модификаций исходного пресса Хьюза.
Разрушение клеток в замороженном виде с помощью пресса Хьюза - один из наиболее эффективных способов разрушения клеточного материала разного происхождения: от бактериофагов до животных тканей. С его помощью можно разрушать клетки бактерий, обычно трудно поддающиеся разрушению (например, грамположительных кокков).
В общем наиболее распространенные физические методы разрушения клеток можно классифицировать следующим образом в порядке уменьшения их дезинтегрирующего действия: пресс Хьюза > вибрационные мельницы пресс Френча > ультразвук > растирание с окисью алюминия.
По устойчивости к разрушению клетки различных микроорганизмов можно расположить в последовательности (в порядке уменьшения): дрожжи > мицелий грибов > грамположительные кокки > грамположительные палочки > грамотрицательные палочки > галобактерии > микоплазмы.
Способ разрушения клеток выбирают в основном эмпирически в зависимости от вида клеток, нужного объема экстракта, чувствительности фермента(ов) к инактивации или изменению в процессе разрушения и необходимости последующего хранения. Часто это приходится делать методом проб и ошибок.