2. Регуляция репликации днк
Процесс репликации ДНК, как и процессы транскрипции и трансляции, складываются из трех этапов: инициации, элонгации и терминации.
Основными особенностями процесса репликации ДНК являются:
полуконсервативный механизм;
прерывистость синтеза (с промежуточным образованием так называемых «фрагментов Оказаки»), протекающего всегда в направлении 5' 3';
наличие РНК-затравки (оРНК, или «праймера») в каждом фрагменте.
На конечных этапах репликации цепочки оРНК выщепляются, а фрагменты объединяются с помощью ДНК-лигазы. Возможно, что та из цепей ДНК, которая синтезируется сразу в направлении от 5' к 3' («лидирующая» цепь), растет непрерывно без формирования фрагментов.
Специфика системы репликации определяется ее ярко выраженным мультиферментным характером. В этом процессе принимают участие две ДНК-полимеразы (I и III) и ДНК-лигаза. Кроме того, для дестабилизации двойной спирали ДНК и «раскручивания» ее цепей необходимы специальные релаксирующие белки: хеликазы и топоизомеразы I (-белок). Восстановление суперспирализации молекулы ДНК осуществляется АТФ-зависимой топоизомеразой II (ДНК-гиразой).
В клетке могут одновременно протекать репликации нескольких типов: кроме редупликации генома имеет место репарационный и рекомбинационный синтез ДНК, а также репликация внехромосомных генетических детерминант — плазмид.
Наиболее жесткая регуляция осуществляется на стадии инициации репликации. Репликация ДНК находится как под положительным, так и под отрицательным контролем белков-регуляторов. В общем виде положительный контроль предполагает, что накопление активатора до порогового уровня, достаточного для инициации нового цикла репликации, должно быть координировано с удвоением массы клетки. Напротив, при отрицательном контроле ингибитор должен синтезироваться лишь в ограниченном количестве вскоре после начала предыдущего цикла репликации (такой ингибитор может быть продуктом гена, локализованного вблизи от начала репликации, транскрипция которого осуществляется только в период репликации этого участка ДНК). В процессе клеточного роста ингибитор разбавляется, а в момент удвоения массы клетки уровень его должен падать ниже критического.
3. Регуляция процесса транскрипции. Механизмы индукции и репрессии
В явлениях индукции и репрессии принимают участие белковые репрессоры, продукты специальных генетических элементов — генов-регуляторов (i-re-нов), способные в определенных условиях тормозить процесс транскрипции — образование информационных РНК (мРНК). Поэтому два упомянутых типа регуляции относят к негативным, или отрицательным, механизмам регуляции метаболизма.
Для
реализации этих механизмов необходима
высокая степень организации генетического
аппарата клетки и существование в геноме
специальных кластеров, формируемых
генами, расположенными в определенной
последовательности в виде так называемых
оперонов
или, в более
общем виде, регулонов,
если контроль
транскрипции осуществляется общим
геном-регулятором.
Различия в этих механизмах сводятся к тому, что в случае индуцибельных белков репрессор, кодируемый геном-регулятором, блокирует транскрипцию структурных генов, взаимодействуя с операторным участком ДНК в отсутствие индуктора (обычно являющегося субстратом), а соединяясь с индуктором, репрессор инактивируется.
Напротив, в случае репрессибельных белков кодируемый геном-регулятором репрессор не активен и не препятствует транскрипции, а взаимодействуя с конечным продуктом метаболического пути (корепрессором), претерпевает аллостерическое конформационное изменение, приобретая способность присоединяться к оператору и блокировать транскрипцию структурных генов.
Катаболитная репрессия
Около 35 лет назад Ж. Моно открыл явление, которое называется диауксией. Он заметил, что рост культуры Е. coli в среде, содержащей в качестве источника углерода какую-либо пару соединений (например, глюкозу и лактозу), проходит через две стадии, представляющие собой две экспоненциальные фазы роста, разделенные отчетливой лаг-фазой.
В
течение первой стадии используется
глюкоза, в течение второй - лактоза. До
исчерпания в среде запасов глюкозы
ферменты метаболизма лактозы не
синтезируются (хотя индуктор все время
присутствует). Метаболизм глюкозы
препятствует индукции синтеза
-галактозидазы
и галактозидпермеазы. Таким образом,
все быстро расщепляющиеся источники
энергии подавляют образование ферментов,
необходимых для усвоения более медленно
расщепляющихся источников энергии, и
это явление называют катаболитной
репрессией.
Синтез всех катаболических ферментов регулируется единственным аллостерическим белком, который обозначают БАК (белок, активируемый катаболитом) или БКР (белок катаболитной репрессии). Его эффектор - нуклеотид, циклический аденозин-3',5'-монофосфат (циклический АМФ) - синтезируется из АТФ. С помощью определённых механизмов внутриклеточная концентрация циклического АМФ изменяется в обратной зависимости от количества АТФ. Уровень катаболитной репрессии пропорционален внутриклеточному содержанию АТФ.
Поэтому, когда клетка растет на быстро расщепляющихся субстратах, внутриклеточная концентрация циклического АМФ низка; когда клетка растет на медленно расщепляющихся субстратах, его концентрация высока. Циклический АМФ был обнаружен во всех исследованных бактериях. Поскольку он не является интермедиатом какого-либо известного метаболического пути, единственной физиологической функцией, которую циклический АМФ выполняет в клетках бактерий, является, видимо, регуляторная функция.
Присоединение циклического АМФ к БАК вызывает в белке аллостерическое изменение, позволяющее ему связываться с хромосомой вблизи генов, кодирующих ферменты, подчиняющиеся катаболитной репрессии; такое связывание стимулирует транскрипцию этих генов. В отсутствие циклического АМФ БАК неактивен.
Итак,
для синтеза ферментов, осуществляемого
под контролем механизма катаболитной
репрессии, необходимо наличие БАК и
относительно высоких внутриклеточных
концентраций циклического АМФ. Мутантные
штаммы, у которых отсутствует способность
к синтезу БАК или циклического АМФ, не
могут вследствие этого синтезировать
многие ферменты.
Репрессия конечным продуктом
Добавление в питательную среду соединения, являющегося конечным продуктом какого-либо биосинтетического пути (например, аминокислоты), вызывает у многих бактерий замедление или быструю остановку синтеза ферментов соответствующего пути. Это явление называется репрессией конечным продуктом. Конечный продукт реакции, который накапливается в клетке, взаимодействует со специфическим апорепрессором с образованием активного репрессора. Активный репрессор препятствует транскрипции генов, ответственных за синтез ферментов данного метаболического пути.
Ферменты, синтез которых обычно подавляется конечным продуктом, могут быть дерепрессированы (т.е. могут синтезироваться быстрее, чем в норме), если внутриклеточная концентрация конечного продукта падает до очень низкого уровня.
Регуляция
синтеза ферментов путем репрессии
конечным продуктом оказывается более
сложной в случае разветвленных путей
анаболизма. В таком случае, если бы один
из конечных продуктов полностью подавлял
образование ферментов, участвующих
также и в синтезе других мономеров, то
это могло бы привести к недостатку
необходимых соединений и задержке роста
клеток. При изучении регуляции синтеза
ферментов разветвленных метаболических
путей обнаружено два следующих механизма:
Изоферменты для общих реакций синтезируются так, что каждый конечный продукт имеет «свой» фермент, синтез которого может быть репрессирован или дерепрессирован. В клетках Е. coli имеются три аспартаткиназы и две гомосериндегидрогеназы; синтез этих ферментов находится под контролем разных конечных продуктов.
Для репрессии синтеза ферментов необходимо, чтобы все продукты, синтезируемые этими ферментами, находились в избытке. Такой вид репрессии называется мультивалентной репрессией, ди- или тривалентной репрессией, если в ней участвуют два или три продукта.