3. Регуляция функционирования аппарата трансляции

Один из возможных способов регуляции аппарата трансляции заключается в селективности рибосом в отношении матрицы - мРНК Необходимая степень селективности рибосом создается, как правило, модификацией (или заменой) их белковых компонентов. Это можно рассматривать как один из видов системной перестройки управления метаболизмом клетки.

Такая перестройка осуществляется, например, при развитии некоторых бактериофагов. Так, в процессе развития Т-четных фагов Е. coli происходит модификация компонентов «сердцевины» бактериальной РНК-полимеразы (РНКП); наряду с этим наблюдается изменение белковых компонентов 30S-субчастиц рибосом, в результате чего резко замедляется трансляция мРНК хозяина, а рибосомы приобретают устойчивость к стрептомицину (поражающему именно 30S-субчастицы). Сходное по характеру изменение специфичности рибосом отмечено в процессе спорообразования у Bacillus subtilis, а также в процессе перехода фототрофной бактерии Rhodopseudomonas palustris от автотрофных к гетеротрофным условиям существования.

Выбор матрицы (мРНК) может осуществляться также на основе специфичности изоакцепторных тРНК. Часть молекул тРНК, присутствующих в клетке, является резервом, который подключается к трансляции при высокой скорости роста. Другие изоакцепторные тРНК могут играть чисто регуляторную роль. Важно отметить, что ряд тРНК обладает практически абсолютной специфичностью только к одному из кодонов, характерных для данной аминокислоты.

Известны случаи, когда при смене условий существования клеток в них резко меняется набор тРНК, взаимодействующих с рибосомами. Так происходит на разных фазах роста Е. coli, а также при переходе от хемотрофии к фототрофии Rhodobacter spaeroides.

Кодирование той или иной аминокислоты может избирательно осуществляться только одним из возможных кодонов. Особенно важно, что некоторые аминокислоты, входящие как в белок оболочки, так и в РНКП фага (лизин, глутамин), избирательно кодируются только одним из кодонов, причем для белка оболочки и РНКП эти кодоны различаются. Указанное обстоятельство открывает возможности для избирательного управления синтезом того или другого белка путем обрыва процесса трансляции в связи с отсутствием необходимой изоакцепторной тРНК.

Возможно блокирование трансляции путем присоединения комплементарной регуляторной РНК (mic-РНК) к участку инициации на мРНК. Процесс трансляции регулируется также путем изменения скорости перемещения рибосом по матрице, мРНК.

4. Способы регуляции биосинтеза и круговорота белков у микроорганизмов путем посттрансляционной модификации и избирательного протеолиза

Посттрансляционная модификация

В клетках эукариот полицистронные матрицы часто транслируются целиком, а образующаяся общая полипептидная цепь в дальнейшем «разрезается» на индивидуальные полипептиды. У организмов этого типа широко распространен также синтез белков в виде более длинных предшественников, которые затем укорачиваются, следовательно, как и в случае синтеза РНК, молекулы проходят стадию «созревания», или «процессинга», характерную для многих пищеварительных ферментов, инсулина, коллагена и других белков. Сходные процессы, хотя и в меньшем масштабе, происходят и в клетках прокариот. Например, -лактамаза Е. coli синтезируется в виде предшественника, содержащего 286 аминокислот, а в процессе секреции укорачивается на 23 аминокислотных остатка. Сходное явление отмечено и для щелочной фосфатазы.

Явление посттрансляционной модификации характерно для большинства экзоферментов и периплазматических белков, которые должны обладать способностью проникать через цитоплазматическую мембрану. На NH₂-конце такого белка синтезируется «лишний», так называемый «сигнальный» или «лидерный» полипептид, определяющий специфическое взаимодействие с определенными компонентами цитоплазматической мембраны. В процессе трансляции этих белков возникает полисомно-мембранный комплекс, а растущий полипептид «проталкивается» через мембрану.

К этой же группе процессов посттрансляционной модификации можно отнести ферментативное присоединение коферментов (биотина, флавинов, гемов и др.) к готовой молекуле апофермента_у а также формирование третичной и четвертичной структуры их молекул.

Избирательный протеолиз

С изменением внешних условий и фазы клеточного цикла содержание некоторых белков и ферментов в микробной клетке заметно меняется. Это связано с тем, что начинают функционировать или прекращают свою деятельность различные ферментные системы. Ставшие ненужными белки и ферменты могут быть подвергнуты деградации (протеолизу) протеолитическими ферментами - протеиназами и пептидазами. Однако время существования различных клеточных белков сильно варьирует: одни деградируют очень быстро, другие значительно медленнее, а большая часть (до 70%) не разрушается.

При аминокислотном голодании, а также при дефиците источников азота, углерода и энергии наблюдается стимуляция внутриклеточного протеолиза. Образующиеся при этом свободные аминокислоты используются для синтеза белка и в метаболических реакциях. Таким образом, процесс деградации белков является одним из проявлений адаптации клетки к изменению условий среды.

Микроорганизмы имеют две системы общей деградации собственных белков. Одна из них активируется в условиях голодания и не требует для функционирования затрат метаболической энергии. Другая, постоянно действующая система белковой деградации, служит для гидролиза аномальных белков, которые появляются в результате мутаций или ошибок биосинтеза, а также белков, играющих важную регуляторную функцию, время существования которых должно быть ограничено. Деятельность этой системы подавляется такими энергетическими ингибиторами, как цианиды или азиды. Каждая из этих систем имеет свой набор протеолитических ферментов.

В клетках бактерий, растущих при постоянных условиях, за час деградирует 1-2% от общего количества белков. При аминокислотном голодании, недостатке источников азота или углерода и энергии, а также фосфора или серы или некоторых других элементов (калия, марганца) наблюдается повышение уровня протеолиза до 4-5% от общего содержания клеточного белка за час. Следует отметить, что одновременное голодание по нескольким факторам не дает дополнительного увеличения скорости внутриклеточной деградации белка.

Стимуляция протеолиза при голодании не связана с синтезом протеиназ de novo - в клетках уже существует набор необходимых ферментов. Активация протеолиза в этих условиях может быть обусловлена изменением концентрации низкомолекулярных эффекторов. С другой стороны, уровень протеолиза возрастает при ограниченном (на 25-60%) снижении содержания АТФ под влиянием ингибиторов дыхания или при голодании по источнику энергии.

Когда содержание АТФ резко падает (на 85—90%), сильно уменьшается деградация всех клеточных белков. Процесс протеолиза внутри клеток происходит в два этапа: на первом происходит модификация белка, зависящая от АТФ; на втором независимо от АТФ осуществляется непосредственный акт протеолиза. Активность большинства известных протеиназ проявляется именно на втором этапе, поскольку для их действия in vitro АТФ не требуется.

АТФ-зависимая модификация белков-субстратов осуществляется при участии белкового фактора протеолиза - убихитина. В присутствии АТФ ковалентно связываются несколько молекул убихитина с молекулой белка-субстрата. Модифицированный белок становится чувствительным к внутриклеточным протеолитическим ферментам, которые расщепляют его до свободных аминокислот. Убихитин играет при этом каталитическую роль.

Таким образом, усиление протеолиза при голодании может быть обусловлено как активацией протеолитических ферментов, так и модификацией белков-субстратов, повышающей их чувствительность к действию этих ферментов.

У микроорганизмов существует постоянно действующая система деградации аномальных белков. Такие белки появляются в клетке в результате мутаций, ошибок биосинтеза (преждевременная терминация, замены аминокислот, включение аналогов) или посттрансляционных поврежде­ний (ограниченный протеолиз). Следовательно, аномальные белки отличаются от нормальных клеточных белков размером и аминокислотным составом. Возникающие при этом изменения в третичной структуре и появление гидрофобных участков на поверхности белковых молекул повышают их чувствительность к действию специфических протеиназ.

Высокоспецифичные протеиназы играют важную роль в регуляции клеточного цикла, в частности при переходе от вегетативного роста к образованию спор у дрожжей и бактерий. В спорах Вас. megaterium уже в течение первых 20 мин прорастания пятая часть всех белков деградирует до свободных аминокислот, которые используются затем для образования биосинтетических ферментов. Расщепление споровых белков осуществляется протеиназами, которые синтезируются при спорообразовании, сохраняются в покоящихся спорах и обнаруживают высокую специфичность к споровым белкам. После деградации споровых белков эти ферменты, в свою очередь, подвергаются протеолизу.

Детальные механизмы регуляции активности протеиназ, участвующих в процессах спорообразования и прорастания спор, в настоящее время не известны.

С деятельностью высокоспецифичных протеиназ связано образование зрелых белков из их предшественников (процессинг белков). Среди них важное значение имеет лидерная (сигнальная) пептидаза, которая отщепляет сигнальный пептид (или препептид), содержащий 15-30 аминокислотных остатков, от аминоконцевого участка секретируемых (экспортируемых) белков. Присутствие сигнального пептида необходимо для осуществления секреции этих белков.

Завершающий этап деградации белков, начатой протеазами, - распад небольших пептидов до свободных аминокислот - осуществляется пептидазами. Одни из них представляют собой аминопептидазы широкого спектра действия, которые последовательно отщепляются по одной аминокислоте с аминоконца пептида, за исключением аминокислот, предшествующих остатку пролина. Последние отщепляются пролинспецифичными пептидазам.

Гидролиз пептидов, образующихся в процессе деградации внутриклеточных белков, а также экзогенных пептидов осуществляют одни и те же пептидазы. Благодаря действию этих ферментов пептиды, добавленные в среду, могут служить для клетки источником аминокислот, в частности поддерживать рост ауксотрофных по аминокислотам мутантов. Именно это обстоятельство используют при получении штаммов, дефектных по пептидазам, которые утрачивают способность к усвоению соответствующих пептидов.

При получении продуцентов с помощью мутагенеза обычно не учитывается тот факт, что часто не удается обеспечить синтез достаточного количества мутантных белков и ферментов, например с измененными регуляторными свойствами, именно потому, что они воспринимаются клеткой как аномальные и подвергаются ускоренному протеолизу. Чужеродные белки, не связанные со специфическими субстратами и структурами микробной клетки, в особенности короткие полипептиды, также эффективно разрушаются. Поэтому применение мутантов, дефектных по протеолизу аномальных белков, а также по пептидазам, представляется перспективным для повышения эффективности промышленных штаммов-продуцентов.

Лекция № 4

|

СПОСОБ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ У МИКРООРГАНИЗМОВ, ОСНОВАННЫЙ НА ИЗМЕНЕНИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ. ПРОСТЫЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФЕРМЕНТЫ. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И ЭФФЕКТОРЫ. ГОМОТРОПНАЯ И ГЕТЕРОТРОПНАЯ КООПЕРАТИВНОСТЬ. ОБРАТИМАЯ КОВАЛЕНТНАЯ МОДИФИКАЦИЯ