книги из ГПНТБ / Дертингер Г. Молекулярная радиобиология. Действие ионизирующих излучений на элементарные биологические объекты

г п А о л *7 ТЕМПЕРАТУРНЫЙ

Г Л А З А 7 _ ^ ^ - . . - г

ЭФФЕКТ

В гл. 5 приведены данные, согласно которым молекулярный вес мишеней для различных ферментов определяли по изме­ ренной при комнатной температуре. Полученный результат срав­ нивали с истинным молекулярным весом облученных биомоле­ кул. Так как не имеет смысла придавать какое-то особое значе­ ние данным измерений, проводимых при комнатной температу-

Погпок частиц,		10'}р/см*
Рис. 48. Инактивация	РНК-азы		протона­
ми с энергией 2 Мэв	при	125	и 300° К.

ре, проанализируем зависимость скорости инактивации от тем­ пературы во время облучения. Эту главу до некоторой степени можно рассматривать как дальнейшее развитие теории мишени. Кроме того, анализ выявит некоторые характерные черты не­ прямого действия (см. гл. 6), значение которых возрастает, если принять во внимание факт удивительного единообразия темпе­ ратурной зависимости ответной реакции многих биологических систем при облучении.

Термином «температурный эффект» обозначают явление, при котором радиочувствительность многих макромолекул и био­ логических систем снижается при уменьшении температуры во время облучения, что выражается в уменьшении наклона кри-

100

вых доза — эффект.	Пример	такого эффекта приведен	па
рис. 48, где показано влияние двух различных температур			на
инактивацию сухой	РНК-азы	протонами с энергией 2	Мэв.

Опыт по инактивации трипсина ускоренными ионами углерода

(рис.	49)	показывает,			что ответная, реакция зависит от темпе­
ратуры во время облучения. Это
наблюдение справедливо по край­
ней мере при инактивации мак­
ромолекул, поскольку					изменения
температуры			образцов			трипсина
до и после облучения не влияют
на радиочувствительность,							опре­
деляемую		при	300° К.
Указанная				закономерность,
однако, в		целом		не	распростра­
няется на такие автономные мик­
роорганизмы,			как	бактерии.				Ча­
сто	наблюдают			пострадиацион­
ный	температурный эффект,							на­
пример влияние температуры								ин­
кубации,		обусловленный				фермеи-
тативно контролируемыми							систе­
мами	репарации			радиационных

повреждений.

Этот феномен,

од­

5

I

I

I

I

I I

нако, не

считается

проявлением

0

1

2-

J

4

собственно

температурного

эф­

Поток частиц,

1012С-ион/смг

фекта, и поэтому

мы

исключаем

Рис.

49.

Инвактивация

трипсина

его из данного рассмотрения.

ускоренными ионами

углерода

при

Тот факт,

что

температурный

комнатной

температуре

(#) и

эф­

эффект — явление

принципиально

фект

нагревания

образцов

до

значимое,

подтверждает

точку

361°К до

( О ) и

после

облучения

( • )

И .

зрения, согласно

которой

биоло­

гическую инактивацию можно сопоставить с элементарными по­ вреждениями, образовавшимися на ранней физико-химической

стадии действия		радиации	(см. рис. 2)-. Так, в случае с трипси­
ном	скорость инактивации		характеризуется той же		температур:
ной	зависимостью, что и		образование	свободных	радикалов
(рис. 50). Оно		обусловлено тем, что		действие радикалов, по

крайней мере в данном случае, — важный первичный этап в про­

цессе	инактивации.
Еще один вид температурного эффекта,					который упоминался
нами	в связи	с обсуждением		непрямого		действия		(см.
разд. 4.6), — различие между			радиочувствительностью				биомоле­
кул в	растворе,	облучаемых	при	температуре		ниже	и	выше
точки	замерзания. Как будет		показано в		дальнейшем			(см.

рис. 56), замораживание снижает чувствительность водного рас­ твора трипсина с ФУД=100. Это вызывается ограничением диф­ фузии образовавшихся при облучении радикалов воды во льду,

10!

что, в свою очередь, уменьшает их взаимодействие с молеку­ лами ферментов. Однако вклад свободных радикалов полностью не исчезает даже в замороженных растворах. Это видно из того, что скорость инактивации трипсина ниже точки замерзания продолжает зависеть от температуры (см. рис. 56). Приведен­ ные результаты заставляют думать, что температурный эффект

Температура,°К

Р и с 50. Зависимость сечения инактивации (Ж) и образования радикалов

(#)в трипсине от температуры [8].

может указывать на непрямое действие излучения. Это предпо­ ложение будет подробно рассмотрено и обосновано в последую­ щих разделах.

7.1. Температурный эффект и непрямое действие излучения

Если точно сформулировать только что высказанное предпо­ ложение, то станет очевидным, что зависящая от температуры доля радиационных эффектов вызывается действием малых радикалов, которые, как известно, встречаются как во влажных, так и в сухих системах (см. разд. 6.4). Поэтому считается, что температурный эффект отражает температурную зависимость константы скорости реакции К, например реакции между ато­ мами водорода и биологическими молекулами. Зависимость от температуры в данном случае выражется известным соотно­ шением:

k = w • е - £ / « т ,

(7.1)

где k' — константа; Т — абсолютная температура; R — универ­ сальная газовая постоянная [1,986 кал/(град• моль)] и Е —

102

энергия активации данной реакции. Экспоненциальный член в уравнении (7.1), согласно больцмановскому распределению энергии, равен относительному числу молекул, которые при температуре Т обладают энергией активации Е. Если принять,

что общее действие излучения состоит из прямого					(независи­
мого от температуры)	и непрямого эффектов, то для				радиочув­
ствительности (при действии				редкоионизирующих	излучений)
и сечения инактивации	(при		действии корпускулярных излуче­
ний) можно предположить		следующее:
для у-излучения
	=		+	е- */* 7 ",	(7.2)
для заряженных частиц
	ст =	св	+	о-! • е - £ / * г .	(7.3)

Основная задача состоит в том, чтобы в первую очередь про­ верить надежность положений. (7.2) и (7.3) и выяснить, суще­ ствует ли возможность определить энергию активации экспери­ ментально, после чего можно делать заключение о реакциях, лежащих в основе этих процессов. Для этой цели уравнение (7.3) переписывается в виде

1п(сг —ст0)= 1 П 0 ! — E/RT.

(7.4)

Откладывая In (а—сто) против 1/Т (график Аррениуса), получим прямую с наклоном E/R, которая непосредственно дает энер­ гию активации Е. Наличие некоторого числа процессов с раз­ личными вкладами энергии, активации в зависимое от темпера­ туры повреждение дает возможность соответственно расширить уравнение (7.3):

о = ст0 + о-! • е ~ £ ' / « г + ст2• е - Е = / * г + . . .	(7.5)
Нам остается выяснить, до каких пределов уравнение	(7.5)

может применяться для описания экспериментальных данных. Как видно из рис. 51, сечение инактивации РНК-азы все время

уменьшается с увеличением 1/Т			(т. е. с уменьшением		темпера­
туры),	стремясь	к постоянному	значению	ниже 100° К. Во всех
опытах,	которые	проводились при очень		низких температурах
[3, 9, 15, 17] в		интервале 4—100° К, существенных			изменений

радиочувствительности не обнаружено. Если вычесть из экс­ периментальных данных постоянный компонент ст0, то величины, полученные при низкой температуре, окажутся на одной прямой с наклоном, соответствующим энергии активации 1 ккал/моль. Отклонение от этой прямой при более высоких температурах свидетельствует о наложении еще одной прямой с энергией активации 6,5 ккал/моль (см. рис. 51).

Пример с рибонуклеазой, однако, не единственный случай, когда влияние температуры можно выразить уравнением (7.5). Понтер и Юнг [7] проанализировали многие из известных экс-

103

периментов и обнаружили, что в температурной зависимости действия облучения можно выделить три компонента, один из которых не зависит от температуры, а два других обладают энергией активации, равной соответственно 1 и 4—6 ккал/моль (табл. 7). Эта зависимость относится не только к инактивации

201

— .

Рис. 51. Зависимость сечения инактивации РНК-азы

протонами с энергией 2 Мэв		от обратной абсолютной
температуры (график Аррениуса) [12]:
J — экспериментальная	кривая:	2 — постоянная фракция;
3— £ i = l ккал/моль;	4 — £2=6,5	ккал/моль.

различных биологических систем, но также к выходу радика­ лов, индуцированных радиацией в сухих органических соедине­ ниях, измеренных методом ЭПР.

Возникает вопрос о том, какие из специфических непрямых процессов непосредственно связаны с этими энергиями акти­

вации. Роль компонента 4—6 ккал/моль		в целом	пока	остается
невыясненной. Что	касается компонента	1 ккал/моль,		то, со­
гласно интересному	опыту Кюрцингера	[11], он	может быть

104

Сводная таблица энергий активации Et и Ег

для описания зависимости сечения реакции сг
от абсолютной температуры		Т на основании уравнения
Объект	Излучение,	Показатель	ккал/люль
Глицин	Аг(ЗЗО)	Радикалы	0,9
Рибонуклеаза	е(3)	Инактивация	1,6
	Р(2)	»	1,0
	d(2)	»	1,05
Лизоцим	е(3)	»	0,62
	а(33)	Радикалы	1,0
	С(100)	»	1,0
Трипсин	d(\8)	Инактивация	1,1
	а(33)	»	1,2
	а(33)	Радикалы	0,95
Гиалуронидаза	е(1)	Инактивация	1,1
Инвертаза	d(4)	»	1,0
	а(8)	»	0,95
ФХ174-ДНК	е(10)	»	Отсутствует
Фаг срХ 174	Р(2)	»	1,0
Фаг Т1	d(4)	»	Отсутствует
	Рентгеновс­	»
	кое (0,05)		1,1
	Р(2)	»	1,0
Фаг БУ-Т1	Р(2)	»	1,0
Споры В. mega-	Рентгеновс­	»	1,06
terium	кое (0,05)

Т а б л и ц а 7

(7.5) [7]

е.,		Литера­
ккал/люль		тура
3,7		[8]
6,1		[5]
6,5		112]
—		[7]
2,54		[5]
5,0		[8]
4,0		18]
4,5		[3]
5,0		13]
3,6		[8]
—	.	[16]
6,0		[14]
6,0		[14]
6,3		[9]
—		[6]
5,4		[1]
—		[2]
—		[8а]
—		18а]
		[17]
—

П р и м е ч а н и е . Д л я всех приведенных	данных найден температуронезависнмый
компонент ст0, в то время как член в Я . можно	определить только с помощью эксперимен­
тов при температуре выше комнатной [ 7 ] .

связан с атомами водорода, которые высвобождаются при об­ лучении органических материалов (см. разд. 6.4) и затем, оче­ видно, взаимодействуют с неповрежденными молекулами. Фаг Т1 подвергался действию тепловых атомов водорода, получен­

ных при облучении	пластиковой фольги протонами с	энергией
2 Мэв с помощью	установки, сходной с той, которая	показана

на рис. 44. Инактивация возрастала экспоненциально с увели­ чением времени воздействия t при всех исследованных темпе­

ратурах. Откладывая 1/гз7 против обратной				температуры, авто­
ры	получили	две прямые	с энергиями	активации	0,65 и
0,95	ккал/моль	(рис. 52).	В первом случае	(метод А)	облучен­

ная тонкая пластиковая фольга содержалась при комнатной температуре и поэтому выход атомов водорода оставался неиз­ менным, в то время как бактериофаги охлаждались до разных температур. Второй случай (метод Б), при1 котором фольга и образец содержались при одной и той же температуре, пред­ ставляет больший биологический интерес, так как макромоле-

105

кулы облучались при низких температурах, а молекулы, отдаю­ щие водород, находились при той же температуре, что и мо­ лекулы, взаимодействующие с водородом. Энергия активации,

равная	0,95±0,1 ккал/моль,	полученная	при этих условиях,
хорошо согласуется с величиной Е=1			ккал/моль,	измеренной
почти	во всех системах, представленных в табл.			7.

I	I	I	\	I	I	I	1	1 — I
	J-	4-	S	В.	. 7	8	9	10
Рис. 52.	Зависимость чувствительности					(I//37;	^37=37% вре­

мени воздействия фага Т1) к атомарному водороду от об­ ратной абсолютной температуры (график Аррениуса):

• — м е т о д А; О — м е т о д Б [И] .

7.2. Зависимость температурного эффекта от ЛПЭ

Данные, приведенные в предыдущих разделах книги, пока­ зывают, что гипотеза температурного эффекта в том виде, в каком она здесь представлена, может оказаться верной. По­ этому желательно подробнее проанализировать выводы этой гипотезы в связи с концепцией теории мишени. Для этой цели

рассмотрим зависимость радиочувствительности		трипсина от
Л Э П при различных температурах	(рис. 53). Представленные
кривые не принимают «классической»	формы, так	как они асим­

птотически не стремятся к нулю при высоких значениях ЛПЭ. Этого именно и следует ожидать в любом случае, поскольку теория Батса и Каца применима к малой молекуле трипсина (см. разд. 5.3). Чувствительность не меняется при низких зна­ чениях ЛПЭ и затем переходит на более низкий и, по всей вероятности, постоянный уровень при высоких величинах ЛПЭ . Разность между чувствительностями при высоких и низких зна-

чениях ЛПЭ уменьшается по мере снижения		температуры до
тех пор, пока радиочувствительность,	наконец,	не становится
независимой от ЛПЭ при температуре	ниже 100° К.

106

Кривые на рис. 53 до некоторой степени объяснимы теорией Батса и Каца [уравнение (5.15)], поскольку температурная зависимость — одна из составляющих величин D | 7 . Снижение температуры вызывает увеличение £>|7 , т. е. перемещение сверху вниз семейства кривых, изображенных на рис. 35. С увеличе­ нием £)|7 расширяется также область, в которой а пропорцио­ нальна ЛПЭ и не чувствительна к действию заряда. Это объ-

д I I I I I				I 1 1 1 1 и		I I	I 1 1 1 . и	|	L_L
20		Ю2			103		10*
			/7/7(7, Мэв-см2-г-1				, .
Рис.	53.	Зависимость			радиочувствительности
(1/Д37) трипсина				от Л П Э		при	разных	темпе­
ратурах.
Пунктирная линия соединяет средние значения ра­
диочувствительности				при	низких и		высоких		значе­
ниях	ЛПЭ-	[31.	'
ясняет независимость			радиочувствительности						от ЛПЭ (см.

рис. 53) для 7, <100°К, а также тот факт, что с уменьшением температуры «точка перехода» чувствительности смещается в область более высоких значений ЛПЭ (см. рис. 53, пунктирная линия). Значение постоянного уровня чувствительности при вы­

соких величинах ЛПЭ до сих пор полностью	не объяснено.
Этот уровень, возможно, связан с явлением	«температурного

спайка», о котором речь пойдет в следующем разделе. Во вся­ ком случае, при помощи уравнения (5.15) можно описывать условия в области низких и промежуточных величин ЛПЭ, ког­

да	чувствительность постоянна. Разложение ее в степенной ряд
при пренебрежении членами высшего порядка дает
	o =	A(L/P)/D%,	(7.6)
где	величина А учитывает	значение интеграла в	уравнении

(5.15) и считается независимой от ЛПЭ в первом приближении.

Величины, содержащиеся	в экспоненциальном	факторе	(заряд
и скорость), выражаются	приблизительно с	помощью	ЛПЭ.

107

Как видно из всего сказанного,	уравнение (7.6)	применимо
только к большим значениям D31,	а также к низким	и промежу­

точным значениям ЛПЭ . Теория Батса и Каца относит действие плотноионизирующих частиц за счет высвобождения вторичных электронов, эффективность которых, как принято считать, со­ ответствует случайно распределенной дозе у-излучения. Поэто­

му если чувствительность к редкоиоиизирующему						излучению
описывается уравнением		(7.2), как было показано для				РНК-азы
Кюрцингером и	Юнгом	[12],	то	при	введении уравнения (7.2)
в уравнение (7.6)	получим
а = A (L/p) (k0		+ V -	e-E'RT)	=	а 0 + а х • e ~ E / R T .	(7.7)

Это означает, что полуэмпирическое предположение (7.3) под­ тверждается теорией Батса и Каца, которая кроме того, пред­ сказывает, что обе величины, а0 и оь прямо пропорциональны ЛПЭ. Согласно уравнению (5.8), обе величины и температурозависимый компонент радиочувствительности (1/Z)3 7 ) не зависят от ЛПЭ. В случае с РНК-азой этот вывод подтверж­ дается непосредственно на основании следующих данных:

электроны с энергией 3 Мэв [5]:

1/D3 7	= (0,005 + 0,06 . e - i°6<Wr +			25	. l™o/RT) м			р а 3 _ 1 ;	( 7 - 8 )
протоны с энергией 2 Мэв [12]:
1/£>37 =	(0,0048 + 0,06 • e - I 0	0 < w r	+	52	. e - 6	5 0	0 / « r )	Мрад^,	(7.9)
дейтроны с энергией 2 Мэв		[7]:
	1/D3 7 = (0,0055 + 0,07)		• е - 1 0 5 0		' * 7	)	Мрад~^.		(7.10)

Принимая во внимание, что облучение дейтронами с энер­ гией 2 Мэв проводилось только при температуре ниже комнат­ ной, нельзя было измерить второй температурозависимын ком­ понент. Предложенные для него значения, очевидно, далеко не точны, так как они получены путем двукратного вычисления разницы между величинами, содержащими некоторые погреш­ ности. Отсюда следует, что разность между коэффициентами в третьих членах уравнений (7.8) и (7.9) статистически недо­ стоверна. Кроме того, не следует упускать из виду тот факт, что до сих пор не совсем ясно значение второго температурозависимого компонента. Не исключено, что он может непосред­ ственно зависеть от ЛПЭ. Таким образом, уравнение (7.7) ока­ зывается основным выражением, с помощью которого теория мишени в известных пределах может быть расширена для ин­ терпретации температурозависимых процессов в той мере, в какой они связаны с непрямым действием излучения.

7.3.Модель «теплового спайка»

Взаключение следует задать вопрос: имеются ли еще и другие возможности для объяснения температурного эффекта? Используем в качестве отправной точки предположение о том,

.1(18

что при высоких значениях ЛПЭ радиочувствительность, по-ви­ димому, достигает постоянного уровня. Возможно, что это отражает некоторые «эффекты трека», значения которых на­ столько сильно возрастают с увеличением ЛПЭ, что анализ распределения 6-излучения- может оказаться недостаточным для точного описания сечения инактивации. Не исключено, что ме­ ханизм таких эффектов трека основан на том, что благодаря отдаче большого количества энергии вдоль трека плотноионизирующих частиц генерируется необычно высокая температура и, следовательно, биологические объекты внутри цилиндриче­ ской тепловой колонки (спайка) определенного диаметра мо­ гут инактивироваться теплом. Это достаточно старая идея, вы­

сказанная	еще Дессауэром	[4]. Затем, однако, о ней забыли,
и только	недавно концепция	«точечного тепла» вновь извлечена

на свет Норманом с сотр. [10, 13] и перенесена на явление, ко­ торое в настоящее время известно под названием «модель теп­ лового спайка».

Для количественного выражения проблемы трек частиц рас­ сматривается как линейный тепловой взрыв, размеры которого определяются ЛПЭ. Тепловая волна взрыва благодаря прово­ димости распределяется радиальио. Внутри цилиндрической зоны это может вызвать подъем температуры до повреждаю­ щего уровня. Формальное математическое описание обеспечи­ вается уравнением теплопроводности, которое для данного случая следующее:

			г-
Т{г, 0 = Г ( 0 , 0) + -		^ — е ~ 4 0	< ,	(7.11)
где t — время после прохождения		частицы;	г — радиальное рас­
стояние от трека	частицы; D — тепловой коэффициент диффу­
зии; с — удельная	теплоемкость и Т — абсолютная			температура.
«Время жизни» экспоненциальной		функции	(7.11)	описывается
с помощью
				( 7 Л 2 )

Учитывая быстрые изменения этой экспоненциальной функции, уравнение (7.11) с большей степенью приближения можно за­ писать следующим образом:

t<t0:T(r,	t) = T(0,	0);	•
t>to'-T(r.t)-T(6,p)	+	-J4~-.	(7.13)

•i

Для' того чтобы иметь возможность определить сечение теп­ лового спайка, в пределах которого произойдет тепловая инак­ тивация, следует принять, что величина T(r, t) в левой части уравнения (7.11) должна достигнуть определенной температуры

109