книги из ГПНТБ / Дертингер Г. Молекулярная радиобиология. Действие ионизирующих излучений на элементарные биологические объекты

часть этих агрегатов может превращаться в мономеры при восстановлении дисульфидных мостиков. В присутствии кисло­ рода от 10 до 60% агрегатов являются результатом дисульфидного обмена. В вакууме процент этот возможно много вы­ ше [13J.

Димеризация является следствием изменений аминокислот.

Она	не служит причиной	потери	ферментативной активности.
Это	подтверждается тем,	что при	облучении в атмосфере IT2S,

в условиях, когда полностью подавляется образование димеров, не обнаруживается значительного эффекта защиты и радиочув­

ствительность РНК-азы далее на 30% выше, чем при	облучении
в вакууме [17]. Один из двух компонентов процесса	димериза-

ции может случайно сохранить ферментативную активность, чем можно объяснить наличие ферментативной активности в дена­ турированных димерах (см. рис. 67).

Какой же процесс вызывает развертывание молекулы, про­ исходящее в 50% случаев, когда наблюдается изменение амино­ кислоты? Часть инактивированных молекул характеризуется

разрывом их пептидных цепей. Это не отражается на картине элюции (см. рис. 67), так как в большинстве случаев изначаль­ но не образуются фрагменты и две части молекулы удерживаются вместе при помощи дисульфидных мостиков (см. рис. 62). Од­ нако такой «замаскированный» разрыв полипептидной цепи можно обнаружить, восстанавливая дисульфидные мостики в облученном компоненте перед хроматографическим разделением. Разрывы обнаруживаются в денатурированных компонентах, но не в ферментативно активных молекулах компонента 1и [13—29]. Это означает, что разрыв пептидной цепи, наряду с изменением аминокислоты, будет неизменно вызывать потерю ферментативной активности. Разрывы сами по себе не обяза­ тельно приводят к инактивации, поскольку присутствие несколь­ ких разрывов, индуцированных ферментативно, не сопровож­

дается потерей, ферментативной активности РНК-азы	(Пфлей-
дерер, личное сообщение). Разрывы не локализуются	в каких-
то нескольких определенных местах, а распределяются	обычно

по всей молекуле. Различные фрагменты можно отделить с по­ мощью электрофореза на крахмальном геле* дающем не менее восьми слабо разрешаемых пиков [13].

По мнению Гаррисона и Уикса [9], разрыв полипептидной цепи связан с образованием одной карбонильной связи и одной амидной группы. Однако до сих пор нет единства мнений в от­ ношении количественных данных.

Доля молекул, несущих разрыв полипептидной цепи, варьи­ рует между 5 [29] и 50% [13] в зависимости от эксперимен­ тальных условий. Таким образом, должен существовать еще какой-то механизм, ответственный за большую часть переходов из активного в неактивное состояние. Развертывание молекулы РНК-азы, возможно, имеет место в случае, когда измененная

140

аминокислота участвует в гидрофобной связи. Если нарушается гидрофобный характер аминокислоты или же если образовав­ шийся остаток имеет другой заряд, то полипептидная цепь обыч­ но принимает другую конфигурацию. Пример с гемоглобином S показывает, до какой степени изменение отдельной аминокисло­ ты может влиять на конфигурацию белка. Свойства мутантного гемоглобина, наблюдаемые при серповидноклеточной анемии, значительно отличаются от свойств нормального гемоглобина. Единственное различие в первичной структуре, состоит в замене гидрофобного валина заряженным аминокислотным остатком глутаминовой кислоты.

При такой предпосылке совершается постоянный переход ак­ тивных молекул в неактивные, что наглядно показано на рис. 69. Величина повреждения будет зависеть от локализации изменен­ ной аминокислоты в молекуле, заряда вновь образовавшегося

остатка и его	гидрофобных	свойств. Если после облучения в
дозе 12 Мрад	в кислороде	различные компоненты РНК-азы

восстанавливаются, а затем вторично окисляются, то при этой процедуре ферментативную активность теряют около четверти молекул типа 1и , а активность компонентов 1 д и П д сокращается на 60—70% [12]. Это означает, что в первичной структуре облу­ ченных молекул происходят изменения, недостаточно значитель­ ные, чтобы вызывать развертывание (и, следовательно, инакти­ вацию), но тем не менее способные помешать правильному свер­ тыванию молекулы после денатурации. Примером чувствитель­ ности молекулы РНК-азы к изменениям в ее гидрофобной об­ ласти могут служить опыты Уайта [36]. В них показано, что активность фермента не изменяется при включении двух сильно ароматических боковых цепей. Однако модифицированная моле­ кула оказывается полностью неспособной обрести первоначаль­ ную конформацию после восстановления.

Во время облучения сухой РНК-азы в вакууме небольшая часть молекул инактивируется с помощью механизма, предло­ женного Платцманом и Франком [28]. Введение электростати­ ческого заряда в молекулу при ионизации ведет к появлению неоднородного электростатического поля, которое поляризует определенные полярные боковые группы, в результате чего на­ рушается ряд водородных связей. Это вызывает изменения в конформации, которые, в свою очередь, приводят к инвактивации. Изменение это обратимо при развертывании и последующем сворачивании молекулы. Об этом свидетельствуют данные, по­ лученные Гаскеллом и Хантом [11], в соответствии с которыми ферментативная активность компонентамономера 1 н анаэробно облученного образца РНК-азы увеличивается на 20% после вос­ становления и реоксидации, в то время как в денатурирован­ ных продуктах облучения в результате этих процессов фермен­ тативная активность резко снижается. Как показывают опыты, с помощью этого механизма разрушается только небольшая

141

часть молекул, облученных в вакууме, в то время как в присут­

ствии кислорода ионизированные	молекулы вступают в реак­
цию и благодаря этому необратимо	изменяются.

Схема инактивации, рассмотренная в этом разделе, описы­ вает большую часть физико-химических и химических измене­ ний, происходящих после облучения РНК-азы, а также процес­ сы, участвующие в инактивации этого фермента. Эта схема правдоподобна, так как она не противоречит данным ЭПР-спек- троскопии и включает сенсибилизирующее действие кислорода, защиты при низких температурах, а также селективный распад нескольких определенных аминокислот в. различных экспери­ ментальных условиях. Кроме того, она объясняет, почему погло­ щение излучения в любой части молекулы с большой степенью вероятности приводит к инактивации, тогда как повреж­ дения, вызываемые химическим путем, во многих случаях не оказывают никакого влияния. Действие химических веществ сосредоточено в основном на поверхности молекулы и поэтому не влияет на внутримолекулярные связи и конформацию моле­ кулы. Напротив, энергия излучения независимо от того, в какую часть молекулы она была внесена изначально, может путем миграции энергии внутрь вызвать инактивацию. Детали этой картины, характерные для РНК-азы, у других ферментов могут быть иными, хотя предположительно обрисованная здесь кар­ тина в целом верна и в этом случае. В какой мере это предпо­

ложение-			справедливо,			можно			будет				решить			лишь		после		того,
как другие ферменты будут исследованы															не		менее		подробно,
чем РНК-аза.
	Л И Т Е Р А Т У Р А
1.	Anba М., Neta P. Int. J. Appl. Radiat. Isotopes,													1965,		16,	227.)
2.	Aroson		D. e. a.	In: Progress			in	radiobiology. Eds.							J.	S.	Mitchell		e. a.	Edin-
	Burgh, Oliver			&	Boyd, 1956,		p.	61.
3. Augenstein L.				G.	In: Symposium				on		information				theory in			biology.		Eds.
	H. P. Yockey e. a. New York, Pergamon Press,													1958,		p.	287.
4.	Augenstein L. G.,				Science,	1959,		129,		718.
5.	Augenstein L. G., Grist K. Cited by									L. G. Augenstein. Adv. Enzymol.,										1962,
	24,	359.
6	Copeland E. S. e. a. Radiation Res.,								1968,		35,		437.
7.	Deering		R. A. Arch. Math. Nat.					(Oslo),			1960,		55, Nr.			5.
8.	Drew	R.	C, Gordy W. Radiation Res.,							1963,		18,		552.
9.	Garrison		W. M., Weeks В. M . Radiation Res.,										1962,		17, 341.
10.	Glazer A. N.. Smith E. L. J. Biol. Chem., 1961, 236, 2942.
11.	Haskill		J. S.,	Hunt J. W.		Biochim.				Biophys. Acta, 1965. 105, 333.
12.	Haskill		J. S., Hunt J. W. Radiation							Res.,		1967,		31,	327.
13.	Haskill		J. S., Hunt J. W. Radiation							Res.,		1967,		32,		606.
14.	Haskill J. S., Hunt				J. W. Ibid., p. 827.
15.	Hayden		G. A., Friedberg F. Radiation Res.,										1964, 22, 130.
16.	Holmes		В. E. e. a. Nature,			1967. 213,				1087.
17.	Hunt J. W., Williams J. F. Radiation									Res.,		1964,		23,	26.
18.	Jung H., Kurzinger K. Radiation Res.,									1968,		36,		369.
19.	Jung	H., Schiissler			H. Z. Naturforsch., 1966,							21,		224.

142

20.Jung H., Schussler H. Unpublished results (1967).

21.Jung H., Schussler H. Z. Naturrorsch., 1968b, 23, 934.

22.Kartha G. e. a. Nature, 1967, 213, 862.

23.Lineweaver H., Burk D. J. Amer. Chem. Soc., 1934, 56, 658.

24.Mee L. K. Radiation Res., 1964, 21, 501.

25.Mee L. K. e. a. Nature, 1964, 204, 1056.

26. Miiller A. In:	Biological effects of ionizing radiation at the molecular le-
vel. Vienna,	Internal. Atomic Energy Agency, 1962, p. 61.

27.Okada S., Fletcher G. Radiation Res., 1962, 16, 646.

28.Platzman R. L., Frank J. In: Symposium on information theory in biology. Eds. H. P. Yockey, R. L. Platzman and H. Quastler. New York, Pergamon Press, 1958, p. 262.

29.Ray D. K., Hutchinson F. Biochim. Biophys. Acta, 1967, 147, 357.

30.Riesz P. e.a. J. Amer. Chem. Soc, 1966, 88, 872.

31.Schussler H., Jung H. Z. Naturforsch., 1967, 22b, 614.

32.Slobodian E., Fleisher M . Biochemistry, 1966, 5, 2192.

33.Smith T. W., Adelstein S. J. Radiation Res., 1965, 24, 119.

34.Smvth D. G. et al. J. Biol. Chem., 1963, 238, 227.

35.Whitaker J. R. Analyt. Chem., 1963, 35, 1950.

36.White F. H. J. Biol. Chem., 1964, 239, 1032.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ Г Л А В А ю В ОБЛУЧЕННЫХ

НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТАХ

Нуклеиновые кислоты играют основную роль в поддержа­ нии жизненных процессов. В то время как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) является носителем генетической инфор­ мации, рибонуклеиновые кислоты (РНК) выполняют важные функции в процессе ее реализации (см. разд. 11.1). Тот факт, что нуклеиновые кислоты занимают ключевую позицию в био­

логических процессах,		делает изучение действия		излучения на
Д Н К и РНК	главным	аспектом	исследования	молекулярной
радиобиологии.	Как и в случае с		ферментами, основная задача
состоит в том,	чтобы связать потерю биологической активности

с физическими и химическими изменениями и, таким образом, добиться понимания механизма инактивации. Возможность из­ мерения многих биологических функций нуклеиновых кислот, равно как и индуцируемых излучением физико-химических изме­ нений в них, позволяет рассматривать одновременно обе сто­ роны действия излучения. Поэтому в первую очередь мы рас­ смотрим физико-химические и химические изменения в облу­ ченных нуклеиновых кислотах, а в трех последующих разделах попытаемся связать эти изменения с подавлением некоторых биологических функций. Это не всегда просто, так как в боль­ шинстве случаев авторы рассматривают лишь один из эффек­ тов. Попытки связать функциональные и физико-химические из­ менения были предприняты совсем недавно, в частности в опытах с бактериофагами. Учитывая то, что РНК исследована гораздо меньше, чем ДНК, рассмотрение вопроса в этой главе будет ограничено исключительно анализом радиационных изменений ДНК.

10.1. Структура ДНК

Изложение экспериментальных методов и полученных ре­ зультатов станет понятнее, если предварительно сделать крат­

кий обзор имеющихся данных	о	структуре		молекулы	Д Н К
(рис. 70). В двухцепочечной Д Н К		два	полинуклеотидных		тяжа
перевиты в двойную спираль,	причем		для каждого типа		Д Н К
характерна определенная последовательность				оснований.	Меж-

144

ду отдельными парами оснований имеются две или три водород­ ные связи, удерживающие вместе тяжи. Оба тяжа можно частично или полностью разделить при нагревании Д Н К в при­ сутствии различных химических веществ. Процессы эти соот­ ветственно называются частичной или полной денатурацией. Ее

/

0

H-NH

/

СНз

А

тмф

о

с н

г ^

ж

, я

_

N

^

н / ^

н

s-H

О

X #

"

п

и

0

W0

, дАМФ

I

Н

HN-H

О

J

/

/ * N ?

i.

?

"

'

w N —

w

/ ~°

^

j

у

| — "

ЩМФ

ОСИ^В^

Ц'/ \

bNK.M-NKhC"Jrj^

Ц

И

Н

^ п

I

м

нгС0

дГМФ

Р

Н

HN-H

О

I

/ г

j 1

н

0

-H-NH

о

j

q—f н н2се дцмФ

, ' /	и
Рис. 70. Структура двухцепочечной Д Н К с водородными	связями.

следует отличать от деградации, которая означает сокращение длины молекул при разрыве одной или обоих полинуклеотидных тяжей.

Диаметр двойной спирали Д Н К примерно равен 20 А. По­ скольку общая генетическая информация бактериофагов или бактерий сосредоточена в одиночной молекуле ДНК, последняя может достигать значительной длины. Геном бактерии Е. coli состоит из двухцепочечной молекулы ДНК, имеющей форму замкнутого кольца, с молекулярным весом 3 -109 дальтон и дли-

145

ной около 1 мм. Это соответствует куску шнура диаметром 1 мм
и длиной 5 км\
При облучении в Д Н К возникают разнообразные	изменения.
Прежде всего в различных участках молекулы Д Н К	образуются

свободные радикалы, что может быть исследовано в сухой Д Н К с помощью ЭПР-спектроскопии. Образование этих первичных продуктов облучения приводит к химическим изменениям, та­ ким, как дезаминпрование или дегидроксилироваиие, разрыв связи основание — дезоксирибоза, окисление дезоксирибозы или же высвобождение фосфатной группы. Эти реакции в конечном

счете приводят		к изменениям	макромолекулярной	структуры
ДНК. В	этой связи нужно различать одно- и двухцепочечные
разрывы	(т. е. совпадающие		и соседние разрывы двух нуклео-
тидных	тяжей)	и поперечные	сшивки двух или более молекул
.ДНК. Эти изменения в структуре макромолекул				отражаются

также и на водородных связях. Исследование этих изменений поможет понять радиационные эффекты в ДНК, хотя разрыв водородных связей са-м по себе обычно не вызывает биологиче­ ских нарушений.

10.2. Индуцированные излучением радикалы

Для начальной фазы химических изменений в облученных нуклеиновых кислотах характерно появление свободных радика­ лов, которые можно наблюдать с помощью ЭПР-спектроскопии. -Литература по этому вопросу настолько обширна, что в преде­ лах этой книги невозможно дать исчерпывающий обзор данной

области исследования. Поэтому мы ограничимся обсуждением
наиболее демонстративных данных. Более подробные		сведения
содержатся в обзорных статьях Циммера и Мюллера		[39, 59].
Количественная ЭПР-спектроскопия	применяется	для опре­
деления выхода радикалов, индуцируемых облучением		в Д Н К и

•ее составных частях. На рис. 71 показаны спектры ЭПР, полу­ ченные при комнатной температуре для четырех наиболее важ­

ных	оснований ДНК. Как уже	упоминалось в разд.	9.3 (см.
рис.	65), по чисто техническим	причинам записывается	только

первая производная сигнала поглощения. Сигналы оснований не обладают сверхтонкой структурой. Исключение составляет сиг­ нал тимина, главный компонент которого состоит из характер­ ного восьмилинейного спектра. Очень близкие спектры получают после облучения при низких температурах с последующим изме­ рением при комнатной температуре. Количество радикалов в образце определяется по интенсивности спектров ЭПР (двух­ кратным интегрированием спектров). Выход радикалов увеличи­ вается в следующем порядке: основание<нуклеозид<нуклеотид (табл. 11). Причина этого становится ясной после обсуждения качественной ЭПР-спектроскопии. Выход радикалов и спектры,' полученные в опытах с ДНК, в большой степени зависят от типа

146

Т а б л и ц а 11

Сравнение величин G для образования индуцированных облучением свободных радикалов в компонентах нуклеиновой кислоты при 300° К [38]

Основание, сахар	с	Нуклеозид	G	Нуклеотид	а
Аденин	0,1	Аденозин	1.4	дАМФ	2,0
Гуанин	0,8	Гуанозин	0,9	дГМФ	3,0
Цнтозин	0,4	Цитидин	1,0	дЦМФ	5,0
Тимин	0,1	Тимидин	0,4	дТМФ	2,0

Р-2-Дезокси-Б-ри- 4 боза

Д Н К и препаративных процедур. Именно	по этой причине зна­
чения, измеренные в разных лабораториях	при 77° К, варьируют

между 0,2 и 12. Это различие еще больше, когда опыты прово­ дятся при комнатной температуре.

Используя качественные измерения ЭПР, можно попытаться идентифицировать радикалы, определяющие спектр облученных

	в
1	i 150з

Рис. 71. Спектры ЭПР оснований Д Н К при у-об- лучении Со6 0 . Облучение и измерение проводили

ввакууме при комнатной температуре [32]:

а— цитозин; б — гуанин; в — аденпн; г — тнмин.

нуклеиновых кислот. На рис. 72 показаны сигналы ЭПР не­ скольких различных препаратов ДНК. Характерно, что восьми­ линейный спектр тимина имеет различную интенсивность и, по свидетельству ряда авторов, обусловлен продуктом присо­ единения атомарного водорода (табл. 12) к Сб-атомам тимина

147

						Т а б л и ц а	12
Некоторые радикалы составных		частей ДНК, идентифицированные в монокристаллах ЭПР спектроскопией.
Сверхтонкое	расщепление относится к изотропной части спектра.
	Число линий;				Число линий;		Лите­
Кристалл	отношение ин-	Радикал	Лите ­	Кристалл	отношение ии-	Радикал
	тенсивноотей		ратура		тенсивностеп		ратура
	расщепления				расщепления

Дезоксиаде-	3
нозинмоно-	1:2:1
гидрат	43,5 э

Дезоксигу-	3
анозингидро-	1:2:1
хлорид	35 э

2

1:1 10 а

иЛ1 s\\ iC-H

) i

0

«/Г V

*ч. J-*

[35]	Цитозин-	6
	моиогидрат	1:1:2:2:1:1
		19 з

Тимиднн	8
[ П ]	1:3:5:7:7:
	:5:3:1
	20,5 э

[12]|3-2-Дезокси- 5

-D-рибоза 1:4:6:4:1 10,55

		[6]
	С	J
	с	с-
	1
	И
	0	[42]
	II
И-Н		C'-CHj
	с
	1
		[29]
	,с-н	о
/	< V	г.>/-ои
НО	Х£	2 С

l

и

[41]. Труднее определить другие компоненты сигнала ДНК, представленные на рис. 72. Первый спектр (а), по крайней мере частично, может состоять из триплета с расщеплением 35 э, который, например, можно идентифицировать с радикалом гуа­ нина (см. табл. 12). Не меньше трех линий содержится в чет­ вертом спектре (см. рис. 72,г). Центральную линию можно

300ьк

Рис. 72. Спектры ЭПР раз-						• 2
личных		облученных		препа-		— • — 1	L
ратов Д Н К [39]:							\	f —
а — Д Н К		спермы	форели		[1*1;		v \	> /
б — Д Н К		тимуса	теленка		[431:		\	/
в	— ДНК.	тимуса	теленка		1151;		\ /	рп„
г	— Д Н К	бактериофага		Т2	[37|.		v	, J

удалить с помощью некоторых препаративных процедур [38], сохранив при этом дублет с расщеплением примерно 20 э, кото­ рый, возможно, объясняется наличием радикала типа —С—Н—. .

I Однако не ясно, в каком месте молекулы Д Н К этот радикал локализуется. Если вычесть восьмилинейный спектр тимина из

спектра б	или е	(см. рис. 72), остается	триплет с	расщепле­
нием примерно 20 э [41], происхождение			которого	также не
очень ясно.
Трудности, возникающие при попытке			сопоставить	основную
•структуру	сигнала	Д Н К с определенными радикалами, при­
водят к тому, что количественный анализ ЭПР должен				включать

149