книги из ГПНТБ / Дертингер Г. Молекулярная радиобиология. Действие ионизирующих излучений на элементарные биологические объекты

растает, с тем чтобы уменьшиться при дальнейшем росте ЛПЭ . Это дает возможность к асимптотическим наклонам этих кривых, служащим мерой радиочувствительности, при действии высоких доз применить рассуждения, приведенные в разд. 5.3. При по­

мощи способа, применяющегося для экспоненциальных

кривых

доза — эффект,

в

выражение для S-образных

кривых

вводится

величина l/D'3V

являющаяся количественной

мерой радиочувст­

вительности. D'37

находят,

проводя прямую

через

начало коор­

динат, параллельную

асимпто­

тической

части

кривой

доза—

эффект. Далее D'^

определяют

так же, как в случаях с одно-

ударными

кривыми. Эти

фак­

торы следует принять во вни­

мание, когда

кривые

инактива­

ции бактерий анализируются

с

помощью

теории

попадания

и

теории мишени. По-видимому,

правильнее

всего

S-образные

кривые рассматривать как од-

иоудариые

и

многом пшенные

кривые. Этот тип кривой под­

робно проанализирован

в гл. 2

[см. уравнение

(2.6)

и

рис. 5.]

Для них

характерны

асимпто­

тическая

экспоненциальная

за­

О

20

40

висимость

и

конечное

экстра-

доза,

крад

поляциоиное

число, равное

чи­

Рис. 101. Инактивация

различных

му­ слу мишений

(см. рис.

5).

тантов Е. coli

рентгеновским излуче­

Мансон

и

Бриджес

[29]

из­

нием (150 кв)

[13].

брали это

объяснение,

иденти­

фицировав

экстраполяционное число с числом хроматидных нитей

на бактерию. Это не лишено смысла, так как в зависимости от стадии роста бактерии могут иметь несколько ядер (хромосом). У- Е. соИу как известно, каждая хромосома реплицируется в те­ чение 90% времени клеточного цикла. Следовательно, среднее число хроматидных нитей на хромосому составляет пример­ но 1,44, а не 1. Таким образом, экстраполяционное число прирав­ нивается числу хромосом на бактерию, умноженному на 1,44.

В опытах с некоторыми мутантами Е. coli В/г Мансон и Бриджес [29] подтвердили, что эти величины в целом справед­ ливы, однако полученные результаты все же недостаточно адек­ ватны, чтобы служить доказательством для всей концепции. Такая простая интерпретация во многих случаях представляется неоправданной, поскольку часто получают чисто экспоненциаль­ ные кривые инактиваций. На рис. 101 приведены экспоненци­ альные кривые доза — эффект для дикого штамма Е. coli В и

210

двух

его

мутантов

В/г

и

Bs-i,

обладающих различной

радио­

чувствительностью.

Несмотря

на

то,

что

все три

штамма

содержат

одинаковое

количество ДНК,

кривые

доза — эффект

имеют

неодинаковый

наклон. Особенно четко в этом отношении

различаются

штаммы

В/г и Bs-i. Эти различия

обусловлены

их

неодима-

/,

ковой

способностью

к ре­

парации.

Нерешенным

остается

вопрос, не лучше

ли

для

описания

радиа­

ционных

кривых

инакти­

вации

использовать

соот­

ветствующее

стохастиче­

ское

выражение,

учиты­

вающее

особенности

об­

разования

колоний

(см.

разд.

3.5).

УФ-и з л у ч е н и е.

Со­

вершенно

. другое

поло­

жение, по-видцмому, на­

блюдается при УФ-облу-

чении

бактерий,

так

как

в

данном

случае

полу­

чают

различные

виды

кривых

инактиваций. Об

этом

свидетельствует

и

рис. 102, на котором при­

ведены

кривые

выживае­

'мм*

мости штаммов кишечной

Рис. 102. Инактивация различных мутантов

палочки

В,

В/г

и

Bs-i.

Е. coli УФ-светом с Х=254 нм [13] (По оси

Наряду

с отчетливо

выра­

абсцисс — доза УФ-излучения).

женной S-образной кри­

вой для

В/г обращает на себя внимание высокая УФ-чувствитель-

ность

Bs-i, которая, правда, с увеличением дозы снижается. До­

вольно своеобразна

кривая доза—эффект дикого штамма Е. coli

В. Несмотря

на заметные

различия в форме кривых, создается

впечатление, что все три кривые асимптотически приобретают одинаковый наклон. Эти три штамма Е. coli различаются только лишь способностью репарировать лучевые повреждения, у дико­ го штамма Е. coli В, очевидно, какую-то роль играет филаментообразоваиие. Для объяснения инактивации кривых в области малых и средних, но не высоких доз можно было бы привлечь интерпретацию, согласно которой форма кривых определяется репарационной способностью клетки. По этому пути пошел Хейнс [14], описавший кривую выживаемости следующим об­ щим уравнением:

N/Na.

(13.1)

211

тде F(D)—число	потенциальных летальных		повреждений	при
дозе D и R{D)—число		репарированных повреждений. Так		как
образование	радиационных повреждений		пропорционально
.дозе, то
		F (£>) = kD.	(13.2)

Хейнс [14] предположил, что с дозой число репарабельных по­ вреждений R{D) возрастает, чтобы затем при более высоких

.дозах достигнуть постоянного уровня насыщения. Наиболее простое математическое выражение, отражающее это предпо­ ложение, следующее:

Я ( 0 ) = а ( 1 - е р ' 0 ) .	(13.3)
Отсюда следует, что кривая инактивации	(13.1) в полуло­

гарифмическом масштабе будет иметь начальный наклон k—а(3

лри £ > а р \ Наклон	этой кривой возрастает с дозой,	асимптоти­
чески достигая k.	В этой модели репарационная	способность

не влияет на конечный наклон S-образной кривой, а размер пле­ ча служит мерилом репарации УФ-повреждений. Плечо харак­ теризуется экстраполяционным числом а, которое отражает максимальное число репарированных повреждений. Для рези­ стентного штамма В/г, согласно рис. 102 [14], экстраполяцион-

ное	число а = 466.			Другими словами, у			Е. coii В/г, в соответст­
вии	с	развитой	здесь схемой,		может		репарнроваться до			46'6
УФ-индуцированных повреждений ДНК.
	Физико-химическое подтверждение репарационной гипотезы
Хейнса получено в опытах Ханавальта							и Хеннса (цит. по [15]),
показывающих,			что включение меченого тимина при репарации
УФ-облученной			бактериальной Д Н К			подчиняется дозной зависи­
мости, сходной			с уравнением		(13.3). Этим инактивационная					мо­
дель		приобретает		значительную долю			вероятности, что также
будет		продемонстрировано в связи				с обсуждением			эффекта	БУ
в следующем разделе. Правда, эти						рассуждения			неприменимы
к случаю с ионизирующим излучением, поскольку									здесь репара­
ционная способность отражается на наклоне								кривой доза — эф­
фект		(см. рис.	101). Прежде		чем перейти к			подробному разбо­

ру репарации радиационных повреждений, мы попытаемся по­ казать, что Д Н К является критической мишенью инактивации, так как от этого в значительной мере будет зависеть достовер­ ность дальнейшей аргументации.

13.3.Бактериальная ДНК как критическая мишень

Вэтом разделе мы ограничимся двумя типами исследова­ ний, одно из которых касается влияния состава оснований на радиочувствительность, а второе — эффекта включения бромурацила в ДНК.

В л и я н и е	с о с т а в а	о с н о в а н и й . Показано, что у мно­
гих бактерий	существует	зависимость между радиочувствитель-

212

ностыо и составом оснований ДНК, выраженным в виде содер­ жания аденина-тимина (А-Т) в процентах. На рис. 103 видна эта корреляция для некоторых видов бактерий при воздействии

как УФ-, так и рентгеновского

излучения.

При этом

чувстви­

тельность для 50% А-Т (Е. coli)

принята

за единицу. Любо­

пытно, что по отношению

к ионизи-

• рующему

излучению

чувствитель­

ность бактерий снижается при уве­

личении содержания'А-Т, в то вре­

мя как при действии

УФ-облучения

наблюдается

отчетливо

выраженное

увеличение чувствительности. Одна­

ко интерпретация

этих

интересных

результатов,

среди

которых,

впро­

чем, часто

встречаются

исключения,

требует

большой

осторожности.

Нельзя забывать, что радиочувстви­

тельность

зависит

не только

от со­

става оснований, но и от множества

других параметров и, в частности,

от репарационной

способности

раз­

личных

штаммов. Это

убедительно

О

25

50

75

доказывается

сравнением

радиочув­

ствительности

различных

мутантов

Содержание А-Т, X

Е. coli

(см. рис.

101

и

102),

кото­

Рис. 103. Влияние состава ос­

рые при идентичном составе осно­

нований

ДН К

на

чувствитель­

ваний существенно различаются по

ность

(отн.

ед.)

бактерий

чувствительности.

Строго

говоря,

(ось

ординат)

к

УФ- (2)

и

такого рода

анализ

радиочувстви­

ионизирующему

(/)

излучени­

тельности

бактерий

следует

начать

ям. В

обоих случаях

содержа­

ние

аденина-тимина

(А.-Т)

в

с подразделения их на группы, не

бактериях:

различающиеся

в

отношении

ос­

Ps.

fluorescens — 40%;

S. marces-

тальных

параметров. Поэтому

это

cens—42%; E . coli—50%; B . sub-

tilis—57%;

M . p y o g e n e s — 6 6 % г и

В .

наблюдение само по себе не дает

cereus—67%

[12,23[ .

достаточных

оснований

для

утвер­

ждения, что ДН К и есть первичная

мишень действия

излучения.

Увеличение чувствительности к УФ-облучению с возраста­ нием содержания А-Т можно объяснить тем, что димеры тимина являются важнейшими из индуцируемых летальных поврежде­ ний при УФ-облучении и что частота их образования несомнен­ но возрастает с увеличением содержания А-Т. Не совсем ясно, почему при ионизирующем облучении наблюдается обратный эффект. Однако возможное объяснение причины этой корреля­ ции, очевидно, лежит в природе индуцированных излучением из­ менений оснований. В табл. 12 приводились некоторые иденти­ фицированные радикалы компонентов ДНК, обнаруженные с помощью ЭПР. Оказалось, что у цитозина, в отличие от всех остальных оснований, воздействие на карбонильную группу

213

сопровождается образованием	радикала СОН'	[7], что,	возмож­
но, ведет к разрыву водородной связи. Образование			радикала
может привести к локальной	денатурации ДНК, объясняющей
увеличение чувствительности	к ионизирующему	излучению при

возрастающем содержании Г-Ц. В этой связи следует напом­ нить, что при ионизирующем излучении эффект БУ, возможно,

объясняется	образованием радикала СОН- (см. разд. 12.5) и что
		радиочувствительность						возрастает			с
		увеличением содержания БУ в составе
		ДНК.
			Э ф ф е к т			БУ.	Включение			галоге-
		низированного				аналога		оснований			в
		состав		бактериальной				ДНК		служит
		убедительным				доказательством				роли
		ДНК как первичной мишени радиаци­
		онного		воздействия. Особенно						важное
		значение			имеет БУ, который					может
		быть включен в Д Н К						вместо	тимина.
		О	его	сенсибилизирующем					действии
		на	ДНК. вирусов				уже говорилось				в
		разд. 12.5, так что в этом								разделе
		будут		рассмотрены			только		эффекты,
		касающиеся Д Н К бактерий. У								бакте­
		рий, как и у бактериофагов,								наблю­
		дается		увеличение			чувствительности,
		если в Д Н К встраивается галогенизи-
		рованное			основание.			Сенсибилизация
Рис. 104. УФ-инактивация		с возрастанием степени замены								увели­
Е. coli В Т - с	нормальной и	чивается			даже	и в тех		случаях, когда
замещенной	бромураци.юм	аналог		содержится			только в		одной		из
Д Н К [22f:		нитей		ДНК [22]. На			рис. 104		показано
/ — тимин: 2 — БУ.		влияние максимальной замены БУ на
		кривую УФ-инактивации безтиминово-
го мутанта	Е. coli В Т - ,	в который			БУ включается относительно

легко. Несмотря на то, что включение БУ существенно умень­

шает	плечо кривой	УФ-инактивации,	асимптотический	наклон
ее практически остается без изменений.			Попытка интерпретиро­
вать	этот результат	только с помощью	инактивационной	гипо­

тезы Хейнса, объясняющей наличие плеча на кривой выживае­

мости репарацией УФ-повреждений, приведет		нас	к выводу,
что включение БУ в ДНК препятствует правильной			репарации,
как это наблюдалось в случае	с вирусами	(см.	разд. 12.5).
Этот вывод подтверждается исследованиями Аоки			с сотр. [1].
Иначе обстоит дело при ионизирующем облучении, когда
после включения БУ возрастает	наклон кривой инактивации

(рис. 105). Как показал Каплан [21], увеличение чувствитель­ ности бактерий, содержащих БУ-ДНК, коррелирует с нараста­ нием числа двойных разрывов нитей Д Н К (рис. 106). Автор

214

лизировал мутант Е. coli К12 й сёдиментировал ДНК в ней­ тральном градиенте сахарозы. В этих условиях двухцепочечные

разрывы нитей Д Н К вызывают нарушения				скорости седимента­
ции. Как видно	из	рис. 106, относительная		седиментация ДНК,
содержащей	БУ,	с увеличением	дозы		снижается	в

три раза быстрее, чем у нормальной ДНК. Такой же эффект сен-

100^ ,

0,1 >		1	1	1		1	L
	О		Ю		20
			Доза, крад
Рис.	105.	Инактивация			рентгенов­			Рис.	106.	Снижение	относительной
ским	облучением			Е. coli		В Т -	с	седиментации нормальной (/) и за­
нормальной			(1)	и	замещенной			мещенной бромурацилом (2) Д Н К из
бромурацилом (2)				Д Н К		[22].		мутанта		Е. coli К 1.2 в	нейтральном
								градиенте сахарозы при у-облучении
								Со 6 0	вегетативных клеток [21].

сибилизации был получен в параллельном опыте, в котором ра­ диочувствительность оценивалась по способности образовывать колонии. Кроме того, Каплан [21] путем седиментации в щелоч­

ном градиенте сахарозы		(опыт такого рода	показан	на рис. 112)
обнаружил, что	в Д Н К	Е. coli, содержащей БУ,		одноцепочеч-
ные разрывы не	репарируются.
При включении БУ		трансформирующая	Д Н К	сенсибилизи­

руется в такой же мере, как и способность образовывать коло­ нии [40]. Этот факт, совместно с другими данными, полученны­ ми в опытах с БУ, показывает, что и у бактерий Д Н К являет­ ся критической мишенью, а также что радиационные поврежде­

ния Д Н К ответственны	за репродуктивную гибель	облученных
клеток.
13.4. Репарация УФ-повреждений
Способность клетки	репарировать повреждения	Д Н К — важ­

ный фактор, определяющий ее радиочувствительность. Эта ре­ парационная способность была тщательно изучена у бактерий, и поэтому можно сказать, что основные принципы репарации у этих объектов на сегодняшний день в целом ясны. Как будет

215

видно из последующих разделов, прежде чем говорить о репа­ рации повреждений, индуцированных ионизирующими излуче­ ниями, не лишено смысла проанализировать процессы репара­ ции после воздействия УФ-излучения. Фотореактивация и тем-

новая

репарация — два

важнейших

механизма

восстановления

от

УФ-поврежденин. Оба эти

процесса,

совершенно

различные

по своей природе, управляются

ферментативно.

Ф о т о р е а кт и в а ц и я. Как показали

самые

ранние

иссле­

дования эффектов УФ-облуче-

ния,

фотореактивация — это

высокоэффективный

процесс,

охватывающий

многие

биоло­

гические

системы.

Начиная с

1904

г. мы

находим

отдельные

упоминания

о

фотореактива­

ции, но только после вторично­

го открытия ее в 1949 г. Кель­

нером

этот

примечательный

процесс

становится

объектом

более пристального

внимания

ученых.

Фотореактивация,

ха­

рактерная также и для виру­

0

20

40

сов

(см. разд.

12.4), осущест­

вляется

ферментом,

элимини­

. Время освещения, мин

Рис.

107.

Внеклеточная

фотореактн-

рующим УФ-повреждения при

участии

света

с длиной

волны

вация УФ-облученной трансформи­

300

и

400 нм.

В

некоторых

рующей

Д Н К из Haemophilus

influen­

zae

после

инкубации

с

экстрактами

случаях

фотореактивация

про­

из

клеток

Е. coli В

(/)

и

Е. coli

текает без

участия

ферментов.

Bphr-

(2)

[34].

Это

так

называемая

непрямая

фотореактивация.

Мы

не

бу­

дем

останавливаться

на

ней подробно,

поскольку до сих

пор

не вполне ясен механизм, лежащий в ее основе [38]. Как пока­ зывает пример с трансформацией (рис. 107), ферментативная фотореактивация может проводиться in vi'tro. Реактивация про­ исходит в том случае, 'когда УФ-облученную Д Н К инкубируют с клеточным экстрактом из Е. coli В, о чем свидетель­ ствует возрастание числа трансформированных клеток с увеличением времени инкубации. Однако если трансформирую­ щую Д Н К инкубировать с экстрактом из мутанта Е. coli В phr", не содержащего фермента фотореактивации, трансформирую­ щая активность остается без изменений. Подобными опытами in vitro доказывается существование следующих этапов процес­ са фотореактивации.

1. Во время инкубации, даже если она проводится в тем­ ноте, фермент образует комплекс с УФ-облученной (но не с необлученной) ДНК, что подтверждается центрифугированием и колоночной хроматографией.

216

2. Димеры пиримидиновых оснований, мономеризующиеся в процессе реактивации, являются основными повреждениями, элиминирующимися при воздействии света.

3. После	освещения ДНК-ферментный комплекс распадает­
ся и процесс репарации завершается.
Кинетику	'образования внутриклеточного комплекса можно

проследить с помощью одиночных вспышек света длительностью

примерно в 1 мсек,		варьируя интервал			между. УФ-облучением
и реактивирующей		вспышкой [11]. В клетках				Bs_i, находящихся
в стационарной фазе роста, при облучении						254	нм в дозе 4,8
эрг/мм2	(1 эрг/мм2	индуцирует примерно 6,5 пиримидиновых ди­
меров	на геном Е. coli)		максимальное		число	комплексов обра­
зуется	приблизительно		за 5 мин	при	комнатной		температуре,
причем	5 0 % — в течение первых			10—15	сек.	При	более высоких

дозах УФ-облучения максимальное число комплексов достигает постоянного предельного значения 20. Не исключено, что эта цифра примерно соответствует числу молекул фотореактивирующего фермента в каждой клетке. У некоторых мутанов Bs_i это число достигает 100 молекул на клетку [10]. Но все же ясны не все детали механизма, посредством которого видимый свет при­ нимает участие в процессе реактивации, хотя фотореактивация элиминирует до 90% УФ-повреждений. Более подробную инфор­

мацию читатель найдет в статьях	Сетлоу [38], а также	Рупер­
та и Харма [35]. Положение гена	(phr), определяющего	продук­

цию фермента фотореактивации на карте бактериальной хро­ мосомы, демонстрируется на рис. 113.

Т е м н о в а я р е п а р а ц и я . Некоторые особенности отли­ чают этот ферментативный процесс от фотореактивации. Вопервых, как показывает название, репарация протекает без участия света. Однако главное отличие заключается в том, что элиминируются не только УФ-повреждения, т. е. димеры пири­ мидиновых оснований, но и повреждения, представляющие со­ бой поперечные сшивки нитей ДНК. Последние возникают при действии на Д Н К алкилирующих веществ, например азотисто­ го иприта, сшивающего два соседних остатка молекул гуанина, лежащих в противоположных нитях ДНК. Репарация повреж­ дений, явно отличающихся по строению от димеров тимина, дает возможность считать, что в случае темновой репарации мы имеем дело с универсальным процессом коррекции, позволяю­ щим выяснить различные изменения конфигурации ДНК. Дей­ ствительно, кроме азотистого иприта имеются еще другие аген­ ты, действие которых также частично снимается при темновой репарации. Наконец, темновая репарация отличается от фото­ реактивации еще и тем, что димеры и сшивки не просто разры­ ваются, а выщепляются из Д Н К в результате сложного процес­ са и заменяются-вновь синтезированными участками. Именно поэтому темновую репарацию часто называют репарацией пу­ тем выщепления.

8 Г. Дертпнгер, X. Юнг

217

Выщепление димеров тимина из УФ-облученной Д Н К одно­ временно было обнаружено Сетлоу и Керриером [39] и Бойсом

иГовардом-Фландерсом [2].

Вих опытах были использованы чувствительные и резистент­ ные к УФ-облучению мутанты Е. coli, в Д Н К которых был пред­ варительно включен Н3 -тимин. После УФ-облучения, за которым следовала инкубация в темноте, клетки лизировали и затем

					осаждали Д Н К при по­
					мощи	трихлоруксусной
					кислоты.		У чувствитель­
					ных мутантов			вся	радио­
					чувствительность					прак­
					тически		оставалась				в
					ДНК, в то время как у
					резистентных			мутантов
					радиоактивные			продукты,
					представляющие					собой
					выщепленные			компонен­
					ты ДНК, были			обнаруже­
					ны в надосадочной					жид­
					кости.	С	помощью				бу-
		60	120	180	м ажной		хром атогр аф ии
		Время	инкубации,	мин	было	установлено,					что
	Рис. 108. Потеря Н3 -тимина			(/) и включе­	этими	компонентами					яв­
					ляются	димеры			тимина,
	ние С1 4 -БУ	(2) в Д Н К УФ-облученных кле­
	ток Е. coli	в зависимости от		продолжитель­	встречающиеся			в виде ко­
	ности инкубации клеток после окончания				ротких	олпгонуклеотидов,
	облучения	[30].			содержащих			не		более
					трех основании. Эти					опы­

ты показали, что димер тимина не расщепляется в темноте, а выщепляется целиком.

Кроме того, эксперименты Петиджона и Ханавальта [30] под­ твердили, что при выщеплении поврежденного участка проис­ ходит ресинтез удаленного материала. Для этих опытов был использован ауксотрофный мутант Е. coli TAU-bar с дефици­ том урацила, а также ряда аминокислот и тимина. Н3 -тимин включался в бактериальную Д Н К в течение двенадцати поколе­ ний. После УФ-облучения клетки выращивались на среде, со­ держащей С1 4 -БУ. С помощью БУ получили четкую картину се­ диментации экстрагированной ДИК. Как показано на рис. 108, активность трития и, следовательно, количество тимина в Д Н К уменьшается при увеличении времени инкубации в БУ-содер- жащей среде благодаря выщеплению УФ-повреждений. Напро­ тив, одновременное возрастание См -активности можно отнести за счет внедрения БУ во время реконструкции ДНК. Петиджону и Ханавальту удалось доказать, что БУ включается во время

репарации ДНК, а не во	время полуконсервативной	реплика­
ции. Они экстрагировали	репарированиую Д Н К из	клеток и

218

центрифугировали ее в градиенте CsCl. Репарированная Д Н К выявлялась в месте локализации «легкой» тимин-ДНК в про­ филе седиментации и без труда опознавалась с помощью ра­ диоактивной метки БУ.

Этот результат можно интерпретировать исключительно в терминах выщепления димеров, беспорядочно распределенных в ДНК, с последующим их замещением БУ. Однако общее ко­ личество включенного БУ столь мало, что не отражается на скорости седиментации относительно «легкой» ДНК. В проти­

вовес этому в	полукоисервативно реплицироваиной Д Н К	БУ
обнаруживается	в составе гибридной Д Н К (т. е. ДНК,	несу­

щей БУ в тиминсодержащих тяжах), а также в виде полностью замещенных БУ тяжей ДНК. Кроме того, БУ встречается и в сегментах ДНК, принимающих участие в репликации. Дегра­ дация Д Н К с помощью ультразвука или ДНК-азы дополни­ тельно доказывает, что БУ встраивается в небольшие участки ДНК. Такие вновь синтезированные участки содержат по край­ ней мере 25, а возможно, и не менее нескольких сотен нуклеотидов. Это означает, что из нити Д Н К выщепляются не только димеры тимина, но также и некоторое количество нуклеотидов, находящихся в непосредственной близости от повреждения. Весьма любопытно, хотя и объяснимо на основании всего ска­ занного, что после предварительной фотореактивации БУ не

встраивается в		Д Н К	и что УФ-чувствительный			мутант ки­
шечной	палочки	Bs-i	не обнаруживает	этого	вида	репарации.
Две	модели темповой репарации, основанные на предложе­
нии Бойса и Говарда-Фландерса [2], а				также	Сетлоу	и Керрие-

ра [39], полностью соответствуют полученным данным. Они из­ вестны как гипотезы «замещения — иссечения» и «иссечения— замещения» [9]. Оба эти механизма, которые в настоящее время считаются идентичными, графически представлены на рис. 109. В механизме выщепления — замещения можно выделить следую­ щие этапы:

1.Узнавание повреждения.

2.Выщепление повреждения путем эндонуклеолитической иицизии и последующей эксцизии (осуществляемой другой эндоиуклеазой или экзонуклеазой).

3.Расширение пробела 5', З'-экзонуклеазой, которое нахо­

дит' отражение в наблюдаемой деградации ДНК.

4. Репаративный синтез при помощи 3', 5'-ДНК-полимеразы, для которой роль матрицы выполняет неповрежденная компле­ ментарная нить.

5. Сшивка конечной фосфоэфирной связи при участии полинуклеотидлигазы.

Модель замещения — иссечения (см. рис. 109, а) стремится избежать образования более протяженных одноцепочечных участ­ ков, чувствительных к силам сдвига и потому угрожающих вос­ становлению ДНК. После инцизии эндонуклеазой репаративный

8* 219