книги из ГПНТБ / Дертингер Г. Молекулярная радиобиология. Действие ионизирующих излучений на элементарные биологические объекты

синтез протекает с помощью весьма необычной полимеразы, «вылущивающей» дефектный участок тяжа до его полного выщепления и замены. Лигаза образует конечную диэфирную связь. Более подробно ферментативные процессы, участвующие в этой репарации, обсуждаются в обзорной статье ГовардаФландерса.

5'	5>
j " V		_	Г		5'		п
>		- Д .	>•			чГ>-
		узнавание			т		t
				J'0f{
		Инцизия				и
Репаратибная репликация					Деградация
— • *			-	<
Воссоединение			репаратибная				репликация
			•WVfe
			Воссоединение
		а			'		5
Рис. 109. Предполагаемые механизмы темповой
репарации:
а — замещение—иссечение:			б — иссечение— замещение |15].
Все еще не решен вопрос о том, согласуется ли гипотеза
инактивации Хейнса		(см. разд.	13. 2)		с этими			моделями	темпо­
вой репарации. Не		исключено,	что	процесс				деградации	пред­

ставляет собой лимитирующий этап, определяющий максималь­ ное число репарированных повреждений, так как при близком

соседстве	УФ-повреждений (т. е. при	высоких' дозах)	имеется
опасность,	что Д Н К будет деградирована до такой степени, что
перестанет	быть репарабельной. Это	предположение	можно

включить в математическое выражение для ограниченной репа­ рационной способности, предполагаемой Хейнсом, а также ис­ пользовать при расчете дозной кривой при условии, что репа­

рация (и, следовательно, выживаемость)					возможна		только		там,
где	повреждения	в	среднем удалены		друг	от друга		больше,
чем	на некое критическое			расстояние. Приложив			эту	формулу
к выживаемости		бактерий		Е. coli В/г (см. рис. 102),			получим		для
этого критического			расстояния величину			примерно		в	300

нуклеотидов. Если сопоставить эту величину с числом нуклеотидов, выщепляемых при действии экзонуклеазы на сегмент ДНК, окажется что у Е. coli В/г удаляется целиком генетиче-

220

ский маркер, содержащий УФ-повреждения, и заменяется вновь синтезированным во время репарации материалом.

В связи с этим необходимо упомянуть, что не только УФиндуцированные летальные повреждения, но также и поврежде-, иия, вызывающие мутации, мбгут быть элиминированы темпо­ вой репарацией. Так, Хилл [16] и Виткин [42] наблюдали, что у штаммов кишечной палочки, не способных удалять димеры пиримидиновых оснований, некоторые мутации индуцируются с большей частотой, чем у штаммов, эффективно репарирующих летальные повреждения.

13.5. Репарация повреждений, вызываемыхионизирующими излучениями

Возникает вопрос о том, приложим ли механизм темновой репарации к случаям с повреждениями, индуцированными иони­ зирующими излучениями, т. е. способен ли он репарировать одиночные разрывы нитей ДНК. Опыты по синергизму УФ- и рентгеновского излучений показывают, что репарация повреж­ дений, вызванных рентгеновским облучением, имеет общие эта­ пы с репарацией повреждений, индуцированных УФ-излучением [13].

На рис. ПО показано, что наклон кривой инактивации при действии рентгеновского облучения для Е. coli В/г увеличивается после предварительного облучения 'бактерий различными доза­ ми УФ-света. Чувствительность Е. coli В/г при этом возрастает, достигая в конечном счете уровня чувствительности Е. coli Bs-i, у которого этот синергизм не проявляется.

С другой стороны, предварительное рентгеновское облучение

только лишь	ликвидирует плечо кривой инактивации	Е. coli В/г,
не меняя ее	наклона (рис. 111). Следовательно, в	обоих слу­

чаях предварительное облучение снижает репарацию последую­ щих радиационных повреждений, что свидетельствует об иден­ тичности некоторых этапов реакций после элиминирования ра­ диационных повреждений, индуцированных у - и УФ-излучения- ми. Такой же вывод можно сделать на основании рис. 101 и 102, поскольку Е. coli В/г более устойчив, чем Bs-i, как к УФ, так и к рентгеновскому облучению. Однако не всегда все происходит именно таким образом. Бриджес и Мансон [3] изолировали му­ тант Е: coli WP2 her- , гораздо более чувствительный к УФ-излу- чению и азотистому иприту, чем штамм hcr+. Однако оба штам­ ма обладали одинаковой чувствительностью к действию у-облу- чения и метилметансульфоната (ММС), алкилирующего аген­ та, вызывающего одиночные разрывы Д Н К in vivo. Подобные результаты были получены и для В. subtilis Сираши и Штрау­ сом [36], а также Рейтером и Штраусом [32].

Эти наблюдения показывают, что репарацию одиночных раз-, рывов цепей можно рассматривать только как часть процессов темновой репарации и что она может происходить даже в тех

221

	Доза,		крад
Рис. ПО. Инактивация Е. coli Б/г рентге­
новским излучением		после		предварительно­
го	УФ-облученпя	в	различных		дозах
{эрг!мм2) '•					6 — 1400ЦЗ].
1 — 0;	2 — 400; 3 — 800;	4 — 1000:		5— 1200;

I		1	I	I	I
О	.		8		16

1(тэрг/мнг

Рис. 111. УФ-инактивацня Е. coli В/г после предварительного рентгеновского облучения в различных дозах {крад):

1 — Q- 2 — 7,7; 3 — 23; 4-3: 5 - 5 0 [13].

случаях, когда невозможна полная темповая репарация УФповреждений. Другими словами, УФ-репарация, очевидно, тре­ бует больших «усилий», чем репарация одиночных разрывов. Бактерии, способные полностью репарировать УФ-индуцирован- ные повреждения, могут также ликвидировать и одиночные раз­ рывы. Но обратное положение не всегда верно. До сих пор не найдены мутанты, резистентные к УФ-излучению, но чувстви­ тельные к рентгеновскому облучению.

Процесс репарации у бактерий после воздействия УФили рентгеновского облучения по-разному влияет на форму кривых доза — эффект. При репарации повреждений, вызываемых малы­ ми дозами УФ-излучения, кривая имеет плечо, тогда как репа­ рация при рентгеновском облучении отражается на наклоне кривых инактивации. Некоторые этапы, сопровождающие репа­ рацию повреждений, индуцированных рентгеновским облуче­ нием, удалось наблюдать экспериментально. К ним относятся,

например,	такие,	как деградация		с последующим ресинтезом
ДНК. Мак-Грас с сотр. [27] сравнивали способность					мутантов
кишечной	палочки		В/г и Bs-i включать Н3 -тимидин		в	Д Н К
после облучения		и	высвобождать	радиоактивность	из	мече­

ной Н 3 - ДНК в среду. Как и следовало ожидать, результаты по­ казывают, что В/г включает больше Н3 -тимидина, чем Bs-i. С другой стороны, Bs_i высвобождает большее количество ра­ диоактивных веществ в среду, чем В/г. У Bs-i рентгеновское облучение индуцирует усиленную деградацию ДНК, не сопро­ вождающуюся восстановительным ресинтезом.

Эти данные свидетельствуют о том, что повреждения ДНК, вызванные рентгеновским облучением у различных мутантов с неодинаковой радиочувствительностью, подвергаются воздей­ ствию экзонуклеазы с разным уровнем активности. Таким об­ разом, кинетика репарации облученных бактерий, по-видимому,

отражает	некое	равновесие		между деградацией,		вызываемой
действием	экзонуклеазы,		и	репаративным	синтезом	(см. также
разд. 13.6). Репарация			одноцепочечиых		разрывов		Д Н К у
Е. coli В/г	была	прослежена		Мак-Грасом и Вильямсом [26]. Они
осаждали	Д Н К	в щелочном		градиенте сахарозы, что			позволило

им определить количество одноцепочечиых разрывов. В каче­

стве экспериментального	объекта был	использован	резистент­
ный штамм Е. coli В/г,	Д Н К которого	содержала Н3 -тимидин.
Профиль седиментации,	полученный	при лизисе	бактерий и

центрифугировании ДНК, представлен на рис. 112. Широкий максимум был отмечен даж'е и в необлученном контроле, пос­

кольку Д Н К у Е. coli		всегда частично		деградирована препара­
тивными	процедурами	(см. рис. 112, а).		Сразу	же после	рентге­
новского	облучения (доза 20 крад)		максимум		сдвигается	вправо
и слегка	расширяется	(см. рис.	112, б), т. е. одиночные цепи
Д Н К осаждаются медленнее, и,			кроме того, масса их распре­
деляется	более гетерогенно, что свидетельствует о том, что обра-

223

зовавшиеся фрагменты имеют неодинаковую длину. Если перед высвобождением Д Н К клетки В/г инкубировать в течение 20 мин при 37° С, то пик лишь незначительно сдвигается в сторону кон­

трольного

пика

(см. рис. 112, в).

Он

восстанавливает

первона­

чальное положение и форму только

в случае, если бактерии инкубиру­

ются

в течение

40

мин

перед

вы­

свобождением ДНК-

Следователь­

но,

большая

часть

одноцепочечных

разрывов

может

репарировать

во

время

инкубации.

Гипотеза

кислородного

эффекта

(см. гл.

8.2)

дополняет

многие

кз

рассмотренных в этом разделе по­

ложений. При анализе было учтено,

что

репарация

радиационных

по

вреждений

касается

только

повреж­

дений 1-го типа, охватывающих

главным, образом

одноцепочечные

разрывы, а также изменения осно­

ваний,

т. е. повреждений,

образова­

ние которых зависит от концентра­

ции

кислорода.

Нерепарабельные

двухцепочечные

разрывы

(тип

2),

напротив, принято считать кислоро-

донезависимыми, что

подтверждает­

ся

данными,

представленными в

40

50

20

10

О

гл.

10.4.

Расстояние

от мениска,

мм

13.6. Генетический

контроль

Рис. 112. Распределение радио­

репарации у бактерий

активности

в

меченой

ДНК,

выделенной из Е. coli В/г пос­

Репарация лучевых

повреждений

ле

рентгеновского

облучения

до

недавнего

времени

считалась

(расстояние

от

мениска

после

90

мин

.центрифугирования

в

специфическим

процессом.

Однако

щелочном градиенте

сахарозы):

детальное

исследование

темновой

а — необлученный

контроль;

б —

репарации

показывает,

что восста­

20 крад,

б е з инкубации;

в — 20

крад,

новление

от

радиационных

повреж­

с п о с л е д у ю щ е й

20-мннутной

инку­

бацией

облученных

клеток

при

дений, по всей вероятности, являет­

37° С; г — 20

крад

с

п о с л е д у ю щ е й

•40-минутной

инкубацией [26].

ся

частью

общей

коррегирующей

системы,

которая

поддерживает

не­

изменность

(стабильность)

жизненно

важных

функций

Д Н К

и,

таким

образом,

обеспечивает непрерывность

генетической

ин­

формации. Далее мы обсудим различные генетические факторы, влияющие на радиочувствительность и, в связи с этим, на фор­

му кривых инактивации.	Изучение	различных	групп	мутантов
Е. coli имеет целью не	только построение генетической карты
репарационных локусов,	но также	выявление	общих	аспектов

224

репарации и связи с другими жизненными функциями, т. е. с генетической рекомбинацией. Более подробная информация со­ держится в статьях Говарда-Фландерса и Бойса [18], Рида [31], Рерша с сотр. [33], Тейлора и Троттера [41].

М у т а н т ы , о б р а з у ю щ и е ф и л а м е н т ы п о с л е УФ- и р е н т г е н о в с к о г о о б л у ч е н и я . Эта, по всей видимости, уникальная группа мутантов включает бактерии, у которых кле­ точное деление продолжается и после облучения, хотя и не соп­

ровождается отделением дочерних	клеток,	что в конечном сче­
те приводит к образованию филаментных		клеток. Наиболее из­
вестный штамм этого типа—дикий	штамм Е. coli В. Его более

высокую по сравнению со штаммом В/г радиочувствительность можно отнести за счет образования филаментов. Поэтому он обозначается как П1+. С другой стороны, облучение нефиламентообразующих штаммов может индуцировать возникновение филаментообразующих мутантов, обозначаемых символами dir - (division irradiation resistance) [33]. Добавление пантоиллактона препятствует образованию филаментов у штаммов dir - и Н1+, что способствует нормальному клеточному делению и образова­ нию колоний. Мутанты dir - соответствуют клеткам Ion («long

form») штаммов Е. coli	К12 [20], которые	также	образуют
филамеиты. По-видимому,	Ion — регуляторный	ген,	влияющий
на синтез ферментов, необходимых для образования			полисаха­
ридов клеточной оболочки.

М у т а н т ы , н е с п о с о б н ы е к т е м н о в о й р е п а р а ц и и У Ф-п о в р е ж д е н и й, н о п р и э т о м н е о б я з а т е л ь н о ч у в с т в и т е л ь н ы е к и о н и з и р у ю щ е м у о б л у ч е н и ю . Чрезвычайно важное наблюдение Говарда-Фландерса с сотр. [19] свидетельствует о том, что темновая репарация контроли­ руется тремя участками бактериального генома, обозначаемыми

uvrA, uvrB и uvrC (не исключено, что имеется даже четвертый
ген). Мутанты эти очень				чувствительны			к УФ-излучению и к
действию алкилирующих				агентов. Однако			мутанты uvr+ и uvr -
в одинаковой степени		резистентны				к агентам,		вызывающим
одноцепочечные	разрывы,			например		к	метилметансульфонату
и редкоионизирующим			излучениям.			Возможно, в некоторых
случаях мутанты	uvr+		могут		репарировать			незначительную
долго повреждений,		которые			при	действии		ионизирующих

излучений обусловлены изменениями оснований. Множествен­ ные мутанты, например u v r A _ B _ , всего лишь на 20% чувстви­ тельнее к УФ-лучам, чем одиночные. Вполне вероятно, что локусы А, В и С не обязательно контролируют отдельные этапы темновой репарации. Большинство мутантов uvr - неспособны восстанавливать бактериофаг клеткой «хозяина». Рерш с сотр.

[33] описали УФ-чувствительные мутанты		кишечной палочки,
известные под названием	мутантов dar-	(«dan< repair»). Не­
смотря на то, что большая	часть мутантов	принадлежит имен­

но к группам А, В и С, все они различаются по способности осу-

225

ществлять восстановление	клеткой	хозяина	(рис. 113),	а также
по ряду других свойств.	Мутанты	syn («synthesis of		nucleic '
acids»), составляющие часть группы uvr С			[33], также	чувстви­
тельны к УФ-излучению. У мутантов syn -			после облучения на­

блюдается значительное снижение синтеза белков и нуклеино­ вых кислот.

Рис. 113. Хромосома Е. coli с несколькими генетиче­
скими		маркерами (внутри) и		генами, играющими
существенную роль			в репарации (снаружи), распо­
ложенными в зависимости от длительности					переноса
от начала конъюгации в рецнпиентиые клетки опре­
деленных штаммов.			Маркеры,	локализация	которых
до	сих	пор точно	неизвестна,	показаны	стрелками
[31,	33,	41].
Таким образом, часть мутантов, о которых только что шла
речь, способна		реактивировать клеткой хозяина Д Н К				фага, не­
смотря на то, что их собственная				Д Н К при	этом не	репари-

руется. И хотя значение этого явления не ясно, оно, тем не

менее, очевидно,	подтверждает предположение, высказанное в
гл. 12. 4, согласно которому		репарация Д Н К фага клеткой			хо­
зяина есть не что иное, как			упрощенный	вариант темновой
репарации собственной Д Н К		клетки.
М у т а н т ы , ч у в с т в и т е л ь н ы е к У Ф - с в е т у и р е н т ­
г е н о в с к о м у	о б л у ч е н и ю .		Как уже упоминалось в гл.		13.5,
существуют мутанты, которые			неспособны	репарировать	пов­

реждения, вызванные УФили рентгеновскими лучами. Это, од­ нако, должны быть двойные мутанты, так как их чувствитель­ ность к рентгеновскому облучению в основе своей, как было по­ казано, не зависит от их способности репарировать УФ-индуци-

226

роваиные повреждения. Соответствующие локусы, ответствен­ ные за чувствительность к рентгеновским лучам, обозначаются ехг («х-rayresistant») или lex и сосредоточены главным образом в области uvrA (см. рис. 113). Лучше всего изучена пара двой­ ных мутантов Е. coli Bs-i и В/г, где В/г следует определить как uvr+ exr+, a Bs-i — как uvr - ехг- . Мутация ехг расположена в области uvrA, а мутация uvr - в области uvr В.

М у т а н ты, н е с п о с о б н ы е к г е н е т и ч е с к о й р е к о м- б и н а ц и и. Мутанты, обозначаемые как гее - , высокочувстви­ тельны как к УФ-свету, так и к рентгеновским лучам. Неспособ­ ность к рекомбинации выражается в том, что при скрещивании Hfr rec - XF~rec - — рекомбинации не происходит. Однако ген гее является доминантным. Это означает, что рекомбинация происходит только в случае, если хотя бы один из партнеров не­ сет интактиый ген гес. Высокую радиочувствительность мутан­ тов гее - не следует рассматривать как свидетельство особой роли рекомбинации в репаративном процессе. В лучшем случае она отражает частичное перекрытие функций репарации и ре­

комбинации, так	как мутация	uvr - дополнительно к мутации
г е с - приводит к	дальнейшему	увеличению радиочувствитель­
ности. Различные	наблюдения	над мутантами гес - позволили

сделать вывод о том, что ген гес (см. рис. 113) является регуля­ тором экзонуклеазы, дающим возможность процессам восста­ новления выйти из-под контроля настолько, что деградация Д Н К становится доминирующим фактором. Отсюда следует, что облу­ чение различных мутантов гес - вызывает неконтролируемую и почти ничем не сдерживаемую деградацию ДНК, за что они и получили название «безудержных» («reckless») мутантов. Эти мутанты постоянно теряют нуклеотиды, даже не будучи облучен­

ными. Имеются также	«осторожные» («cautious») мутанты гес~,
у которых деградация	Д Н К протекает	менее	активно, чем в
клетках дикого типа. Эта «гипотеза регулятора»			подтверждает­
ся данными о том, что у мутантов гес -		уровень	активности не­

которых ферментов, действующих на ДНК, не отличается от та­ кого же уровня у штаммов гес+ [5, 8]. Любопытно, что мутация гес- , как правило, не влияет на реактивацию клеткой хозяина, к примеру фага Т1. Это заставляет думать, что последний, очевид­ но, имеет собственный ген гес.

13.7. Micrococcus radiodurans

Все приведенные выше рассуждения о радиочувствительно­ сти и процессе репарации у бактерий, казалось бы, находятся в противоречии с явлением, которое, судя по всему, уникально для мира микроорганизмов, а именно с ответной реакцией на

облучение М. radiodurans,	получившего это название в связи
с его непомерно. высокой	радиорезистентностью. На рис. 114

изображена кривая выживаемости этого организма при рентгенооблучении в анаэробных условиях. Для нее характерно не-

227

обычно большое плечо, за которым следует экспоненциальный спад. D'31, равное примерно 70 крад, определяется по наклону экспоненциальной части кривой. Эта величина сравнима с £>37 резистентного штамма Е. coli В/г, равная 7—8 крад, так как, говоря о резистентности М. radiodurans, нельзя забывать, что клетки микрококка содержат примерно лишь 1/8 общего коли­

чества

ДН К кишечной

палочки,

Д, 7

М. radiodurans

не зави-

сит

от

парциального

давления

кислорода.

Этот довольно

не­

обычный факт. Он противоре­

чит данным,

полученным в

опытах с другими

бактериями,

у которых

фактор

кислородно­

го эффекта возрастает с уве­

личением

радиорезистентности

(см. гл. 8.3, табл. 8).

Отсюда

можно

заключить,

что на асимптотическом

участ­

ке кривой

рис. 114 М. radiodu­

rans

инактивнруется

одними

лишь

двухцепочечными

разры­

вами,

тогда как все остальные

повреждения

практически

пол­

0

0,4

0,8

1,2

ностью ликвидируются

в

про­

цессе

репарации.

Доза,Мрад

Что же

означает

необычно

Рис.

114.

Инактивация Micrococcus

большое

плечо,

характерное

radiodurans

рентгеновским

облуче­

нием [6].

для

кривых,

получаемых

как

при

рентгеновском

облучении

(см. рис. 114), так и при действии УФ-света

[37]? Опыты

с ком­

бинированным облучением, подобные тем, что были описаны для Е. coli В/г (см. рис. 110, 111), дают нам некоторую информацию об этом явлении. Однако ответная реакция М. radiodurans на комбинированное облучение ультрафиолетом и рентгеновскими лучами существенно отличается от реакции Е. coli В/г. По дан­ ным Мосли и Лейзера [28], кривая выживаемости при УФ-облу- чении лишена плеча, если микрококк предварительно подвергал­ ся действию ионизирующего излучения. Удивительно, что подоб­ ный эффект имеет место и при обратном порядке облучения. В

отличие от данных, полученных со штаммом Е. coli			В/г, конеч­
ный наклон кривой выживаемости при рентгеновском			облучении
не	увеличивается после предварительного	УФ-облучения, хотя
и	в данном случае плечо кривой исчезает.	Эти данные свиде­

тельствуют о том, что кинетика репарации повреждений, индуци­ рованных УФ-излучением и рентгеновскими лучами, одинакова в обоих случаях. Другими словами, плечо кривой выживаемости при рентгеновском облучении указывает на «УФ-подобную» ре­ парацию радиационных повреждений. Этот формальный анализ, безусловно, не позволяет судить о физико-химической природе

228

повреждений, репарируемых в области плеча. Но именно в этом

отношении М. radiodurans ведет					себя	совершенно		неожиданным
образом: он			оказывается	способным		репарировать		двухцепочеч-
ные разрывы			ДНК-
	К этому заключению можно прийти на основании формы кри­
вой	доза — эффект, представленной					на	рис. 114.	Из значений
С,	известных		для образования		двухцепочечных			разрывов в
ДНК, можно			рассчитать,	что при дозе			500 крад в среднем об­
разуется		несколько двойных разрывов					на молекулу, хотя при
этой дозе		наблюдается		практически		100%-ная		выживаемость

клеток. Репарацию двухцепочечных разрывов впервые описали

Дин и сотр.	[6], обнаружившие сразу	после облучения	множе­
ство двойных	разрывов, выявлявшихся	по уменьшению	вязкости

извлеченной из клеток ДНК. Этот результат свидетельствует о

том,	что ДН К микрококка по резистентности		не превосходит
остальных		форм ДНК. Если же, однако, Д Н К была		экстрагиро­
вана	после	двухчасовой инкубации, вязкость	ее не	отличалась

от вязкости контрольной ДНК; таким образом, во время инку­ бации должна была иметь место репарация двойных разрывов. Репарации, несомненно, способствует то обстоятельство, что ДНК у микрококка окружена нуклеонротеидом, препятствую­ щим расхождению поврежденных нитей ДНК. Механизм репара­ ции двухцепочечных разрывов пока остается загадкой. После воздействия УФ- и рентгеновскимизлучением у М. radiodurans наблюдают высвобождение фрагментов ДНК, что указывает на наличие механизма, подобного механизму выщепления, ко­ торый обнаруживается у других резистентных бактерий [25, 37].

Для примера укажем, что эффективность выщепления димеров тимина после УФ-облучения у микрококка такова, что Сетлоу [37] сравнила ее с «молекулярным стриптизом».

Главу мы заканчиваем анализом этой необычной клеточной системы. Сведения, почерпнутые из этой, а также из предшест­ вующих глав (11 и 12), позволяют в заключительной главе об­ судить связь между уровнями сложности биологической орга­ низации и радиочувствительностью. В качестве ведущих исполь­ зованы проблемы, которые в ходе обсуждения выкристаллизо­ вались как основные. Такими проблемами оказались вопрос о критической мишени действия радиации и репарация радиацион­ ных повреждений.

	Л И Т Е Р А Т У Р А
1.	Aoki	S., Воусе			R. P., Howard-Flanders P. Nature. 1966, 209, 686.
2.	Воусе R. P., Howard-Flanders						P. Proc.	nat. Acad.	Sci.	(Wash.),	1964,
	51,	293.		.		^
3.	Bridges			B. A.,	Munson	R. J. Biochem.		Biophys. Res. Commun.,			1966,
	22,	268.
4.	Bridges			B. A.,	Munson R. J. In: Current			topics in	radiation research.
	Voi.		IV. Eds. M . Ebert			and	A. Howard. Amsterdam,			North-Holland
	Publ.		Co., 1968, p. 95

229